Entstehung von SARS

Jul 05, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3334 (2023) Diesen Artikel zitieren

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COVID-19-Patienten, bei denen das Risiko einer schweren Erkrankung besteht, können mit neutralisierenden monoklonalen Antikörpern (mAbs) behandelt werden. Um das Entweichen des Virus aus der Neutralisierung zu minimieren, werden diese als Kombinationen verabreicht, z. B. Casirivimab + Imdevimab, oder bei Antikörpern, die auf relativ konservierte Regionen abzielen, einzeln, z. B. Sotrovimab. Die beispiellose genomische Überwachung von SARS-CoV-2 im Vereinigten Königreich hat einen genomorientierten Ansatz ermöglicht, um auftretende Arzneimittelresistenzen bei Delta- und Omicron-Fällen zu erkennen, die mit Casirivimab+Imdevimab bzw. Sotrovimab behandelt wurden. Mutationen treten innerhalb der Antikörperepitope auf, und bei Casirivimab+Imdevimab sind bei aufeinanderfolgenden Rohdaten mehrere Mutationen vorhanden, die sich gleichzeitig auf beide Komponenten auswirken. Mithilfe von Oberflächenplasmonenresonanz- und pseudoviralen Neutralisationstests zeigen wir, dass diese Mutationen die Antikörperaffinität und neutralisierende Aktivität verringern oder vollständig aufheben, was darauf hindeutet, dass sie durch Immunumgehung verursacht werden. Darüber hinaus zeigen wir, dass einige Mutationen auch die neutralisierende Aktivität von impfinduziertem Serum verringern.

Fälle einer SARS-CoV-2-Infektion wurden erstmals Ende Dezember 2019 in Wuhan1 gemeldet, und das Virus verursachte schnell eine globale Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Bis Juni 2022 wurden über eine halbe Milliarde Fälle gemeldet, mit mehr als sechs Millionen Todesfällen (https://covid19.who.int/). Da es sich bei SARS-CoV-2 um ein Positivstrang-RNA-Virus handelt, hat sich SARS-CoV-2 schnell weiterentwickelt, obwohl seine Polymerase über eine gewisse Fähigkeit zum Korrekturlesen verfügt, wobei bereits Tausende von Mutationen identifiziert wurden2. Bestimmte Mutationen können Fitnessvorteile bringen, indem sie die Übertragbarkeit erhöhen oder die Umgehung humoraler Reaktionen ermöglichen, die durch natürliche Infektionen oder Impfungen hervorgerufen werden.

Seit Beginn des Ausbruchs haben sich mehrere besorgniserregende Varianten (VoC) (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/variants/variant-classifications.html) entweder weltweit3,4,5 oder regional6 als dominante Stämme herauskristallisiert. 7. Diese Varianten enthalten mehrere Mutationen, die hauptsächlich im Gen zu finden sind, das für den viralen Spike kodiert, das wichtigste Oberflächenglykoprotein, das für eine Virusinfektion entscheidend ist. Die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des Spikes, die durch Interaktion mit dem ACE2-Rezeptor des Wirts den Viruseintritt in die Wirtszelle initiiert, ist das Hauptziel für wirksame neutralisierende Antikörper (mAbs). mAbs zielen auf zwei verschiedene Arten auf die RBD ab: Die meisten binden an eine Region auf oder in unmittelbarer Nähe der ACE2-bindenden Oberfläche der RBD, wodurch sie die Interaktion von Spike mit ACE2 verhindern und somit die Infektion blockieren8,9, andere binden an Nicht-ACE2 Blockierungsstellen auf dem RBD, und diese mAbs können dazu dienen, den trimeren Spike zu destabilisieren10,11,12.

Eine medikamentöse Behandlung kann die Entwicklung von Krankheitserregern vorantreiben und zu einer schnellen Selektion vorteilhafter Mutationen und der Entstehung resistenter Stämme führen13. Dieser Prozess kann zum Scheitern der Behandlung führen; und die Ausbreitung von Resistenzen kann zu neuen Infektionswellen führen. mAbs werden normalerweise in gefährdeten Bevölkerungsgruppen verschrieben, in denen Infektionen aufgrund der Immunsuppression des Wirts bestehen bleiben, was die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von Resistenzen weiter erhöht (https://assets.publishing.service.gov.uk/ Government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/ 1039516/S1430_NERVTAG_Antiviral_drug_resistance_and_use_of_Direct_Acting_Antiviral_Drugs_.pdf). Es gibt möglicherweise zwei Möglichkeiten, eine Mutationsflucht zu vermeiden. Erstens könnte ein Cocktail aus Therapeutika entwickelt werden, um gleichzeitig verschiedene Stellen auf dem Ziel zu binden, was bedeutet, dass der Erreger, um zu entkommen, zwei oder mehr Mutationen entwickeln muss, was die Chancen auf ein Entkommen drastisch verringert. Medikamentencocktails werden eingesetzt, um die Entstehung von Escape-Mutationen durch eine Reihe von Krankheitserregern wie HIV14 und TB15 zu verhindern. REGEN-COV ist eine Kombination aus zwei vollständig menschlichen, nicht konkurrierenden mAbs, Casirivimab (REGN10933) und Imdevimab (REGN10987), die beide auf die ACE2-Bindungsschnittstelle von SARS-CoV-2 RBD abzielen und die RBD/ACE2-Interaktion blockieren16. In-vitro-Experimente zeigten, dass die Kombination ausgewählte Mutanten neutralisieren kann17 (https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/therapies/anti-sars-cov-2-antibody-products/anti-sars-cov-2-monoclonal-antibodies/ ) unter Verwendung einzelner Komponenten18,19. Ein früherer Bericht deutete auch darauf hin, dass die Behandlung mit REGEN-COV sowohl in präklinischen als auch in Humanstudien wahrscheinlich nicht zum Auftreten von Escape-Mutanten führen würde20.

Eine zweite therapeutische Strategie zur Verhinderung der Entstehung von Escape-Mutationen wäre die Entwicklung von Therapeutika, die auf ein hochkonserviertes Epitop abzielen, das mutationsbeschränkt ist. Das heißt, eine Mutation eines solchen Epitops wäre mit hohen Fitnesskosten für den Krankheitserreger verbunden, wodurch jeglicher Selektionsvorteil zunichte gemacht würde . Sotrovimab (VIR-7831/S309) bindet im Bereich des N-verknüpften Glykans an Position 343 des SARS-CoV-2-RBD; Obwohl es die ACE2-Bindung nicht beeinträchtigt, ist es in der Lage, das Virus wirksam zu neutralisieren21. Da dieses Epitop unter menschlichen und tierischen Isolaten der Sarbecoviren der Gruppen 1, 2 und 3 (einschließlich SARS-CoV-1)21 relativ gut konserviert ist, wurde Sotrovimab (entwickelt aus einem mAb, der aus einem mit SARS-CoV-1 infizierten Fall isoliert wurde) als a breit neutralisierend und vielleicht sogar als Monotherapie in der Lage, der Mutationsflucht zu widerstehen. Das Epitop ist jedoch anfällig für Mutationen mit Sotrovimab, was zu einer etwa sechsfachen Verringerung der Neutralisierung der Omicron-Variante führt5.

In dieser Arbeit berichten wir über den Nachweis viraler Mutationen, die mit Arzneimittelresistenzen bei Patienten verbunden sind, die mit REGEN-COV (bei Infektion mit der Delta-Variante) und Sotrovimab (bei Infektion mit Omicron-Varianten) behandelt werden. Wir nutzen die beispiellosen genomischen Überwachungsbemühungen für SARS-CoV-2 im Vereinigten Königreich und entwickeln einen genomischen Ansatz zur Erkennung neu auftretender Arzneimittelresistenzen (https://assets.publishing.service.gov.uk/ Government/uploads/system/ uploads/attachment_data/file/1090992/11072022_SARS-CoV-2_Therapeutics_Technical_Briefing_4.pdf). Wir bewerten das Bindungsverhalten dieser Virusmutanten mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und untersuchen ihren Einfluss auf die neutralisierende Aktivität therapeutischer Antikörper mithilfe pseudoviraler Tests. Bemerkenswert ist, dass die Delta-Variante Mutationen an zwei verschiedenen Zielorten von Casirivimab bzw. Imdevimab erwirbt, was zu einer schweren Beeinträchtigung der neutralisierenden Aktivität des Cocktails führt. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Omicron BA.1-Variante an mehreren Stellen einzelne Mutationen hervorruft, wodurch die Bindungs- und Neutralisierungsaktivität von Sotrovimab vollständig aufgehoben wird. Schließlich ist der Neutralisationstiter der Impfseren gegen diese Escape-Mutanten im Vergleich zum Ursprungsstamm (d. h. Delta- oder BA.1-Varianten) deutlich reduziert.

Die vorliegende Analyse umfasst alle Patienten, die im Vereinigten Königreich behandelt wurden, von denen bis zum 12. April 2022 mindestens eine Probe entnommen wurde, für die eine virale Gensequenz verfügbar war und deren Infektion als Delta, BA.1 oder BA klassifiziert wurde .2. Unsere Analyse umfasste 17.284 Sequenzen, die von 12.927 Patienten vor der Behandlung entnommen wurden (Tabelle 1, Tabelle 1). In der Hauptanalyse wurden Sequenzen als Nachbehandlung betrachtet, wenn Patienten mindestens 10 Tage nach dem Tag der Behandlung Proben entnommen wurden: 1627 Sequenzen von 938 Patienten, die mit Casirivimab+Imdevimab, Molnupiravir, Nirmatrelvir plus Ritonavir (Paxlovid), Remdesivir oder Sotrovimab behandelt wurden .

Wir verglichen die Aminosäurehäufigkeiten zwischen Sequenzen vor und nach der Behandlung. Stratifizierung der Analysen nach Behandlung, Variante (Delta, BA.1 oder BA.2) und Gen. Neun Aminosäurereste zeigten eine signifikante (p < 0,001, einseitiger Fisher-Test) Häufigkeitsänderung in den Nachbehandlungssequenzen im Vergleich zu den Vorbehandlungssequenzen, was auf einen möglichen Hinweis auf eine Selektion hindeutet. Alle behandlungsbedingten Substitutionen lagen im Spike-RBD-Bereich: E406D/Q, G446S/V, Y453F und L455F/S bei mit Delta infizierten und mit Casirivimab+Imdevimab behandelten Patienten; P337R/S und E340A/D/K/V, K356T und R493Q bei mit BA.1 infizierten und mit Sotrovimab behandelten Patienten; und E340K bei mit BA.2 infizierten und mit Sotrovimab behandelten Patienten (Abb. 1). Für Molnupiravir, Remdesivir und Paxlovid wurden in den verfügbaren Daten keine signifikanten (p < 0,001) Mutationen beobachtet.

a Mit Delta infizierte und mit Casirivimab/Imdevimab behandelte Patienten (n = 1557 vor der Behandlung und n = 67 nach der Behandlung), b mit BA.1 infizierte und mit Sotrovimab behandelte Patienten (n = 3221 vor der Behandlung und n = 148 nach der Behandlung). -Behandlung) und c mit BA.2 infizierte und mit Sotrovimab behandelte Patienten (n = 1338 vor der Behandlung und n = 25 nach der Behandlung). Die Aminosäurehäufigkeiten wurden zwischen Proben vor und nach der Behandlung (mindestens 10 Tage nach der Behandlung) an jeder Stelle im Spike-Sequenz-Alignment verglichen. Die P-Werte für jeden Standort wurden mithilfe eines einseitigen Fisher-Tests berechnet, und die p-Werte wurden zur Visualisierung logarithmisch transformiert und invertiert, sodass Standorte mit divergierenden Werten weiter oben in der Abbildung erscheinen. Es werden nur Stellen mit einer gewissen Variabilität (>1 Aminosäure) angezeigt. Die horizontalen Linien zeigen p-Wert-Schwellenwerte von p < 0,001, p < 0,0001 usw. an. Reste mit unterschiedlichen Häufigkeiten (p < 0,001) werden rot hervorgehoben, wobei die beobachtete Aminosäureveränderung im Text angegeben ist. Rückstände, von denen bekannt ist, dass sie mit den einzelnen Medikamenten interagieren, sind oben in der Abbildung in Blau und Lila angegeben. Neun Standorte sind in der Abbildung rot hervorgehoben: E406D/Q (p = 9 × 10−4), G446S/V (p < 10−16), Y453F (p = 0,000809) und L455F/S (p = 9 × 10). −6) bei mit Delta infizierten und mit Casirivimab+Imdevimab behandelten Patienten; P337R/S (p < 10–16) und E340A/D/K/V (p < 10–16), K356T (p < 10–16) und R493Q (p = 1,8 × 10–5) bei mit BA infizierten Patienten .1 und mit Sotrovimab behandelt; und E340K (p = 0,000369) bei Patienten, die mit BA.2 infiziert und mit Sotrovimab behandelt wurden. Siehe auch Abbildung S1. Für Mehrfachvergleiche wurden keine Anpassungen vorgenommen.

Beschränkt man die Berechnung auf die drei Gruppen mit identifizierten Zusammenhängen: Patienten, die mit Delta infiziert sind und mit Casirivimab+Imdevimab behandelt werden, und Patienten, die mit BA.1 oder BA.2 infiziert sind und mit Sotrovimab behandelt werden (Tabelle 1), insgesamt 86 Nachbehandlungspatienten (≥ 10 Tage) Sequenzen von 59/240 (24,59 %) Patienten hatten mindestens eine der identifizierten Mutationen, verglichen mit 15 Sequenzen von 14/6116 (0,20 %) Patienten vor der Behandlung (Tabelle 2; p < 10–16, ein- einseitiger Fisher-Test). Von 1557 mit Delta infizierten und mit Casirivimab+Imdevimab behandelten Patienten entwickelten 11 (0,70 %) nach 10 Tagen eine Mutation, verglichen mit 46/3221 (1,43 %) mit BA.1 infizierten und mit Sotrovimab behandelten Patienten und 2/1338 (0,15 %). %) Patienten, die mit BA.2 infiziert und mit Sotrovimab behandelt wurden, was auf vergleichbare Fluchtraten für die beiden mAbs hindeutet. Elf Patienten nach der Behandlung hatten >1 Mutation: Drei mit Delta infizierte Patienten, die mit Casirivimab+Imdevimab behandelt wurden, hatten eine Kombination aus G446V und L455F, einer hatte G446S und L455S und einer hatte G446V und Y453F. Wir untersuchten die Rohdaten und bestätigten, dass bei allen diesen Patienten beide Mutationen in den meisten zusammenhängenden Rohdaten vorhanden waren. Von den mit Sotrovimab behandelten BA.1-Patienten hatten vier eine Kombination aus E340A und R493Q, einer hatte E340D und R493Q und einer hatte K356T und R493Q.

Die Analyse wurde mit einem anderen Schwellenwert für Nachbehandlungssequenzen wiederholt: mindestens einen oder fünf Tage nach der Behandlung. Während die Datensätze bei Betrachtung eines kürzeren Intervalls viel größer waren, wurde die Stärke des Signals mit zunehmender Intervalllänge stärker, was die Gültigkeit unserer Ergebnisse untermauert (Abbildung S1).

In unserem Datensatz haben wir nach Patienten gesucht, deren Sequenzen vor und nach der Behandlung entnommen wurden. Wir fanden 25 Patienten mit Delta-Infektionen und übereinstimmenden Sequenzen, von denen sieben von der Wildtyp-Aminosäure zu einer der identifizierten behandlungsbedingten Substitutionen wechselten (Tabelle 2). Von den 49 BA.1-Patienten mit übereinstimmenden Sequenzen hatten 19 eine behandlungsbedingte Substitution. Emergente Substitution. Der einzelne BA.2-Patient mit einer Vor- und Nachbehandlungssequenz war an Position 340 von E zu K mutiert.

Schließlich haben wir ausgewertet, wie oft die behandlungsbedingten Mutationen in Gruppen auftraten, die mit einem anderen Medikament behandelt wurden. Bei BA.1/BA.2-Patienten, die nie mit Sotrovimab behandelt wurden (n = 985), wiesen 0,25 % die R493Q-Mutation auf. Bei Delta-Patienten, die nie mit Casirivimab und Imdevimab behandelt wurden (n = 1555), wiesen 0,34 % die G446V-Mutationen auf. Keine der anderen Mutationen wurde in diesen Gruppen gefunden, was darauf hindeutet, dass alle behandlungsbedingten Mutationen hochspezifisch für das entsprechende Medikament waren.

Für jede identifizierte Mutation haben wir ab September 2022 deren Häufigkeit in der britischen Genomdatenbank ermittelt. Die Häufigkeit der zuvor im britischen Genomdatensatz für Mutationen im Zusammenhang mit Casirivimab und Imdevimab in Delta-Sequenzen aufgeführten Mutationen (n = 763.511) betrug: 6 E406D; 7 E406Q; 163 G446S; 1946 G446V, 12 Y453F; 179 L455F; 1 L455S. Die Häufigkeit von Mutationen nach Sotrovimab-Behandlung mit der BA.1-Variante (n = 742.992) betrug: 11 P337R; 32 P337S; 39 E340A; 82 E340D; 52 E340K; 5 E340V; 57 K356T; 1214 R493Q. Die Häufigkeit von Mutationen nach Sotrovimab-Behandlung mit der BA.2-Variante (n = 407.161) betrug: 10 E340K. Wie oben beschrieben, hatten insgesamt 86/719 (12,1 %) Patienten nach der Behandlung (≥ 1 Tag) mindestens eine der identifizierten Mutationen; Die Häufigkeit jeglicher Mutation in den interessierenden Varianten im genomischen Überwachungsdatensatz betrug nur 3653/1.862.686 (0,20 %, identisch mit der Häufigkeit im Vorbehandlungsdatensatz; p < 10–16, einseitiger Fisher-Test).

Insgesamt zeigen diese Daten eine signifikante Anreicherung von Mutationen in den Nachbehandlungssequenzen im Vergleich zur Vorbehandlungsgruppe und im Vergleich zur gesamten Genomdatenbank, was stark darauf hindeutet, dass es sich dabei um Mutationen handelt, die zur Flucht aus der mAb-Therapie ausgewählt wurden.

Abbildung 2 zeigt die Positionen der Mutationen mit hoher Signifikanz. Alle Mutationen treten in der RBD des SARS-CoV-2-Spikes auf.

ein Modell des Omicron RBD (7TLY), angedockt mit S309 (Sotrovimab). Omicron RBD wird in einer ungefähren Vorderansicht als graue Fläche dargestellt, S309 als Cartoon-Bänder mit getrennt eingefärbten schweren und leichten Ketten. Auf der RBD-Oberfläche abgebildete Mutationsstellen sind magentafarben gefärbt und markiert. b Nahaufnahme der Schnittstelle zwischen den Resten P337, E340 und K356 mit der schweren Kette S309. Mögliche Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen werden als grüne gestrichelte Linien dargestellt. c Modell des Delta RBD, angedockt mit den REGEN-COV-mAbs Casirivimab und Imdevimab, dargestellt aus ungefährer Vorder- (links) und Rückansicht (rechts). Delta RBD wird als graue Oberfläche dargestellt und die Mutationsstellen E406, G446, Y453 und L455 sind magentafarben und beschriftet. d Nahansicht der Schnittstelle zwischen E406, Y453 und L455 mit Casirivimab. e Nahaufnahme der Schnittstelle zwischen G446 und Imdevimab. Mögliche Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen werden als grüne gestrichelte Linien dargestellt.

In Abb. 2a sind die mit der Sotrovimab-Behandlung verbundenen Mutationen der Struktur des Omicron BA.1 RBD- und Sotrovimab-Komplexes zugeordnet (7TLY [https://www.rcsb.org/structure/7TLY])22. Beachten Sie, dass sich die RBD-Reste 337, 340 und 356 eng zusammenballen und einen Interaktions-Hotspot insbesondere mit der schweren Kette des Antikörpers CDR3 bilden (Abb. 2b). W105 und F106 des CDR3 bilden ein wichtiges 4-schichtiges hydrophobes Sandwich mit den Resten 337 und 356 des RBD (W105:P337:F106:K356), während E340 die CDR3-Schleife durch eine bemerkenswerte Reihe von Wechselwirkungen mit den Amidstickstoffatomen von festlegt Reste 104–106, die eher als offene Helix angeordnet sind, die mit exquisiter Spezifität durch E340 abgedeckt ist. Dies legt nahe, dass die beobachteten Mutationen P337R/S; E340A/D/K/V; K356T wird diesen Bindungs-Hotspot stören. Im Gegensatz dazu liegt Q493R distal zum Epitop, am Rand des ACE2-Fußabdrucks (Abb. 2a), sodass es keinen offensichtlichen Grund dafür gibt, dass diese Mutation die Antikörperbindung beeinflusst.

Die mit Casirivimab- und Imdevimab-Behandlungen verbundenen Mutationen sind in Abb. 2c dargestellt und der Struktur des Delta-RBD zugeordnet, das die L452R-Mutation (7ORB [https://www.rcsb.org/structure/7ORB])19 enthält, wo die Bindung erfolgt von Casirivimab und Imdevimab wird aus der berichteten Struktur des Komplexes mit früher pandemischer RBD (6XDG [https://www.rcsb.org/structure/6XDG]) abgeleitet, der RMSD in Cα-Positionen zwischen frühen pandemischen und Omicron BA.1 RBDs beträgt 1,16 Å und wir sind zuversichtlich, dass diese Schlussfolgerung sicher ist. Die beobachteten Mutationen fallen in zwei Bereiche auf der Oberfläche des RBD. Die Positionen 406, 453 und 455 sind in der Nackenregion8 zusammengefasst, liegen unter dem CDR1 der schweren Kette von Casirivimab und bilden ein Nest von Wechselwirkungen (Abb. 2d). Es ist zu erwarten, dass diese Mutationen die Bindung dieses Antikörpers beeinflussen. Im Gegensatz dazu liegt G446 eng an N57 und Y59 der leichten Kette CDR2 von Imdevimab an (Abb. 2e), und es ist zu erwarten, dass jede Änderung an einer größeren Seitenkette, wie die beobachteten G446S/V-Mutationen, die Bindung aufhebt.

Wir haben eine Gruppe pseudotypisierter Lentiviren23 erstellt, die den Spike der identifizierten Escape-Mutanten exprimieren (Abb. 3). Pseudovirale Neutralisationstests zeigten, dass die Aktivität von Imdevimab gegen die Delta+G446V-Mutante vollständig ausgeschaltet war, während Casirivimab eine >10-fache Reduktion des Neutralisationstiters von Delta+Y453F (16-fach), Delta+L455F (17-fach) und zeigte Delta+L455S (155-fach), im Vergleich zur Wildtyp-Delta-Variante (Abb. 3A, C)

A Pseudovirale Neutralisationskurven der angegebenen Delta-Varianten mit REGEN-COV-mAbs. Der Vergleich erfolgt mit Omi-12 A VH1-58 mAb, der nicht empfindlich auf die nach der REGEN-COV-Behandlung gefundenen Mutationen reagiert. Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. n = 2 biologisch unabhängige Experimente. B Pseudovirus-Neutralisationskurven für BA.1-Sotrovimab-Mutanten. Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. n = 2 biologisch unabhängige Experimente. C, D Mittelwert der Neutralisations-IC50 ± SEM-Titer für die in A, B gezeigten Neutralisationen.

Da Casirivimab gegen die Delta+G446V-Mutante voll wirksam blieb und Imdevimab die Delta+Y453F- und Delta+L455F/S-Mutanten weiterhin wirksam neutralisieren konnte, behielt die Kombination von Casirivimab und Imdevimab die Neutralisierungswirkung gegen alle diese einzelnen Mutanten. Die kombinierten Mutationen von Delta+G446V + Y453F und Delta+G446V + L455F führten jedoch nicht nur zum vollständigen Ausschalten der neutralisierenden Aktivität von Imdevimab, sondern auch zu einem schwerwiegenden Ausschalten der Casirivimab-Aktivität. Infolgedessen wurde der Neutralisationstiter von Casirivimab+Imdevimab um das 1097-fache gegenüber Delta+G446V + Y453F und um das 318-fache gegenüber Delta+G446V + L455F reduziert. Dies steht im Einklang mit dem oben beschriebenen Befund, dass diese Mutationspaare gemeinsam auf einzelnen Delta-RBD-Sequenzen auftreten.

Um zu bestätigen, dass die beobachteten Auswirkungen auf die Neutralisierung direkt auf die Änderung der RBD/mAb-Wechselwirkung zurückzuführen sind, haben wir die Affinität von mAbs und RBD-Mutanten durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR) gemessen (Abb. S2, S3, Tabelle 3A). Diese Analyse zeigte auch, dass die G446V-Mutation die Bindung von Imdevimab nahezu aufhob und in der Zwischenzeit zu einer geringfügigen Verringerung (1,8-fach) der Bindungsaffinität von Casirivimab führte (Tabelle 3A). Die Einzelmutationen L455S, E406D und E406Q betreffen hauptsächlich Casirivimab. Die SPR-Analyse zeigte eine 369-fache, 20-fache bzw. 38-fache Abnahme der Affinität von Casirivimab für Delta+L455S, Delta+E406D bzw. Delta+E406Q. Der Neutralisationstiter von Casirivimab war gegenüber diesen drei Mutanten um das 65-fache, 2-fache bzw. 12-fache reduziert (Abb. 3C, Tabelle 3A). Da Imdevimab jedoch nicht betroffen war, behielt die Kombination aus Casirivimab und Imdevimab eine starke neutralisierende Aktivität gegen diese Mutanten.

Interessanterweise wurde für die Kombination von Mutationen ein additiver Effekt auf die Verringerung der Casirivimab-Bindung beobachtet, der insgesamt zu einer 347-fachen Abnahme der Affinität für G446V + Y453F und einer 192-fachen Abnahme für G446V + L455F führte. Wie erwartet war die Bindung von Imdevimab an Delta+G446V + Y453F und Delta+G446V + L455F fast vollständig beeinträchtigt. Insgesamt hat der Erwerb von Doppelmutationen zu einem erheblichen Verlust der Empfindlichkeit gegenüber dem REGEN-COV-Regime geführt.

Die BA.1-Mutationen P337R/S und E340A/D/K/V führten zum vollständigen Ausschalten der Neutralisierung durch Sotrovimab (Abb. 3B, D). Obwohl BA.1 + R493Q (Reversion zum Wuhan-Wildtyp) ebenfalls als nach der Behandlung auftretende Mutation identifiziert wurde, wurde kein offensichtlicher Effekt auf die neutralisierende Aktivität von Sotrovimab beobachtet. Die RBDs von BA.1 + P337R/S und BA.1 + E340A/D/K/V wurden erfolgreich exprimiert, um die Untersuchung ihrer Bindung mit Sotrovimab zu ermöglichen (Abbildung S3). Die Affinität von Sotrovimab war im Vergleich zum Wildtyp-BA.1-RBD um das 1951- bis 20241-fache reduziert, was erklärt, warum diese Mutanten gegen die Neutralisierung von Sotrovimab resistent waren (Tabelle 3D).

Neutralisationstests wurden mit Serum durchgeführt, das 28 Tage nach einer dritten Dosis des Pfizer-BioNtech-Impfstoffs BNT162b224 gewonnen wurde (Abb. 4). Nach 3 Dosen BNT162B wurde eine 1,9-fache bzw. 1,5-fache Abnahme für Delta+G446V + Y453F bzw. Delta+G446V + L455F im Vergleich zum Wildtyp-Delta beobachtet (p < 0,0001); während für BA.1 + P337S, BA.1 + E340K und BA.1 + K356T jeweils eine 2-fache, 1,2-fache und 3,8-fache Reduktion im Vergleich zum Wildtyp-BA.1 beobachtet wurde (p < 0,0001, p = 0,0082 und p < 0,0001).

Die reziproken IC50-Plasmaverdünnungstiter für Delta REGEN-COV-induzierte Mutationen und BA.1-Sotrovimab-induzierte Mutationen werden mit den Titern für die Vorfahrenstämme Victoria, Delta und BA.1 verglichen. Das geometrische Mittel der Titer wird über jeder Spalte angezeigt. Für die Analyse wurde der Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Test verwendet und es wurden zweiseitige P-Werte berechnet. Unterschiedliche Farben weisen auf unterschiedliche Pseudoviren hin, die unterhalb der Grafik angezeigt werden.

Es wurde gezeigt, dass Personen, die mit der derzeit vorherrschenden SARS-CoV-2-Omicron-Variante infiziert sind, im Vergleich zu früheren Varianten ein geringeres Risiko für schwere Erkrankungen und Krankenhausaufenthalte haben. Allerdings leiden immer noch viele Menschen an schweren Erkrankungen25 und dieser Anteil könnte in Bevölkerungsgruppen mit einem geringeren Grad an infektions- oder impfstoffinduzierter Immunität höher sein.

Obwohl die aktuellen Sterblichkeitsraten viel niedriger sind als im Jahr 2020 (https://www.ons.gov.uk/peoplepopulationandcommunity/healthandsocialcare/conditionsanddiseases/articles/coronaviruscovid19latestinsights/deaths), starben im Juni 2022 jeweils über 300 Menschen an COVID-19 Woche innerhalb des Vereinigten Königreichs (https://coronavirus.data.gov.uk/details/deaths). Besonders gefährdet sind Personen, die durch die Impfung keine ausreichende Immunantwort aufbauen können oder für die eine Impfung nicht empfohlen wird. Es ist diese gefährdete Bevölkerungsgruppe, die tendenziell an chronischen COVID-19-Infektionen leidet und gezielt mit mAb-Therapien entweder therapeutisch oder prophylaktisch behandelt werden soll. Im Vereinigten Königreich haben die immunsupprimierten klinischen Untergruppen mit dem höchsten Risiko Anspruch auf diese Therapien (https://www.gov.uk/ Government/publications/higher-risk-patients-eligible-for-covid-19-treatments-independent). -Beratungsgruppenbericht/Definition-der-klinischen-Untergruppen-mit-dem-höchsten-risiko-bei-gemeinschaftlicher-Infektion-mit-Sars-Cov-2-bei-der-Erwägung-der-Verwendung-von-neutralisierenden-monoklonalen-Antikörpern).

Während sich kommerzielle therapeutische Anti-SARS-CoV-2-mAbs als wirksame Behandlungsmethoden für COVID-19 erwiesen haben26,27, wurde in verschiedenen Studien von einer starken Verringerung oder völligen Ausschaltung ihrer neutralisierenden Aktivitäten gegen Omicron-Varianten berichtet5,22,28,29. Da Sotrovimab nachweislich nicht in der Lage war, Omicron BA.2 wirksam zu neutralisieren, gab die FDA im April 2022 bekannt, dass Sotrovimab nicht mehr zur Behandlung von COVID-19 zugelassen sei, da BA.2 zur dominanten Variante wurde (https://www.fda.gov /drugs/drug-safety-and-availability/fda-updates-sotrovimab-emergency-use-authorization) und im Vereinigten Königreich wird Sotrovimab nicht mehr häufig eingesetzt.

In einer aktuellen Studie wurde berichtet, dass die Delta-Variante bei mit Sotrovimab behandelten Patienten P337L/T- und E340K/A/V-Resistenzmutationen entwickelt30. Hier berichten wir über die Identifizierung von BA.1-Escape-Mutationen bei Patienten, die eine Sotrovimab-Behandlung erhielten. Zusätzlich zu den Mutationen, die an den Resten P337 und E340 auftreten, identifizieren wir auch eine neue K356T-Mutation. Diese Mutationen heben die Bindungs- und damit neutralisierende Aktivität von Sotrovimab auf. Q493R wird ebenfalls gefunden, eine Umkehrung der Sequenz, die in frühen Pandemieviren und in BA.4/5 gefunden wurde. Diese Mutation befindet sich distal zum Sotrovimab-Fußabdruck und hat keinen Einfluss auf die Antikörperbindung, es wurde jedoch berichtet, dass sie die Affinität für ACE2 erhöht (Wang et al., 2022), was darauf hindeutet, dass eine verbesserte Rezeptorbindung und nicht ein Entkommen aus der Antikörperbindung der Auslöser für die Selektion sein könnte . Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Monotherapie wahrscheinlich durch neu auftretende Varianten beeinflusst wird und eine behandlungsbedingte Resistenz induziert, selbst wenn das Medikament auf ein Epitop abzielt, das bei Sarbecoviren relativ konserviert ist.

Im Gegensatz zum Einzelwirkstoff Sotrovimab dürfte das REGEN-COV-Regime, das eine Kombination aus zwei mAbs enthält, die auf nicht überlappende Epitope abzielen, resistenter gegen Mutationsflucht sein. Tatsächlich haben frühere Studien gezeigt, dass REGEN-COV die Entstehung von Escape-Mutanten nicht nur in vitro, sondern auch in In-vivo-Tier- und Humanstudien wirksam verhindern konnte18,20. In unserer detaillierten Studie beobachten wir jedoch, dass die Behandlung mit dem Doppelwirkstoff REGEN-COV bei einigen Personen dazu führte, dass die Delta-Variante Mutationspaare erwarb, die gleichzeitig die Bindung beider Komponenten von REGEN-COV beeinträchtigten, was zu bis zu 1000 führte -fache Reduzierung der Neutralisationstiter. Alle von uns identifizierten Mutationen wurden in einer Kartierungsstudie vorhergesagt, bei der die Auswirkungen jeder potenziellen Mutation im Spike-Protein getestet wurden. Die Studie ergab, dass Pseudoviren mit einer E406W-Mutation beiden REGEN-COV-Verbindungen entkommen konnten31. Diese Mutation trat in unserem kleinen Datensatz nicht auf. Für diesen Aminosäurewechsel sind zwei Nukleotidwechsel erforderlich; Es wurden jedoch einzelne Nukleotidveränderungen an der Stelle identifiziert und als signifikant befunden.

Es ist ungewiss, wie das Virus während der Therapie die kombinierten Resistenzmutationen erlangen konnte. Es wurde jedoch eine beschleunigte Virusentwicklung bei immungeschwächten Patienten dokumentiert, die über viele Monate hinweg an persistierenden SARS-CoV-2-Infektionen leiden konnten, wobei Mutationen überwiegend im RBD gefunden wurden und andere Regionen der Spitze32. Eine Möglichkeit besteht darin, dass bei solchen Patienten bereits vor der Cocktail-Behandlung Viren mit Mutationen aufgetreten sind, die gegen eine Komponente von REGEN-COV resistent sind, und das Medikament dann die Selektion einer zweiten Mutation vorangetrieben hat, was zu einer allgemeinen, möglicherweise beschleunigten Beeinträchtigung der Therapie geführt hat durch virale Rekombination. Wenn eine beschleunigte Virusevolution das Entkommen durch einen Bystander-Effekt erleichtert hat (z. B. Mutationen, die durch die Modulation der Rezeptorbindung ausgelöst werden), könnte dies ein zusätzliches Argument für den Versuch sein, neutralisierende Antikörper zu finden, die in konservierteren Regionen binden, obwohl wir feststellen, dass eine erhöhte Rezeptoraffinität ausgewählt wird bei einigen BA.1-infizierten Patienten, die mit Sotrovimab behandelt wurden, das ein relativ konserviertes Epitop bindet. Bei Patienten unter der REGEN-COV-Behandlung wurden jedoch Viren mit einzelnen Escape-Mutationen identifiziert. Bei einer wirksamen Kombinationstherapie würden diese Mutanten durch eine der Komponenten neutralisiert. Dies wirft die Frage auf, ob die Konzentration der mAbs in vivo möglicherweise nicht das gewünschte Niveau erreichen kann, beispielsweise aufgrund einer begrenzten oder unterschiedlichen Bioverfügbarkeit in bestimmten Teilen des Körpers, wodurch ein günstiges Umfeld für die Resistenzentwicklung von Viren geschaffen wird. Es standen keine Patientenproben zur Verfügung, um die endogene Neutralisation vor der Behandlung zu testen.

Der einfachste Weg, das Entkommen zu verhindern, ist wahrscheinlich die Verwendung eines komplexeren Cocktails aus nicht konkurrierenden mAbs. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass eine solche Kombination die antivirale Wirksamkeit über bis zu elf aufeinanderfolgende serielle Passagen beibehalten konnte20. Eine weitere Option ist die Kombination von mAbs mit antiviralen Medikamenten oder die Entwicklung klinischer Ansätze basierend auf dem Patientenprofil und der Verwendung der richtigen Dosis für die Bioverfügbarkeit. Es könnte auch wichtig sein, vor der Verabreichung einer mAb-Therapie eine Genotypisierung auf Varianten durchzuführen, insbesondere bei chronisch infizierten Fällen mit geschwächtem Immunsystem33. Patienten, denen eine Behandlung wegen COVID-19-Infektionen verschrieben wird, beginnen jedoch in der Regel noch am selben Tag mit der Therapie, sodass die Bearbeitungszeit zwischen Probenahme und Sequenzanalyse für den klinischen Einsatz erheblich verkürzt werden müsste.

Schließlich ist es besorgniserregend, dass der Neutralisationstiter des Impfserums gegen Escape-Mutanten verringert war, die sich aus beiden Behandlungsregimen in zwei verschiedenen Virusvarianten entwickelten. Dies ist nicht ganz überraschend, da die für den therapeutischen Einsatz ausgewählten mAbs auf wichtige neutralisierende Epitope auf dem SARS-CoV-2-RBD abzielen. Ob die mAb-Therapie die Entstehung neuartiger hoch übertragbarer Varianten vorantreiben kann, ist nicht klar. Unsere Studie mit In-vitro-Neutralisation gibt keinen Hinweis darauf, wie geeignet diese Varianten für die Allgemeinbevölkerung wären. Es erscheint auch unwahrscheinlich, dass die durch mAb verursachte Flucht bei der extrem kleinen Anzahl von Patienten, denen eine Therapie verabreicht wird, die Entstehung neuer Varianten deutlich beschleunigen wird, verglichen mit dem, was in der Pandemie insgesamt geschieht, wo jeden Tag Millionen von Infektionen in immer natürlicher exponierten oder exponierten Regionen auftreten geimpfte Bevölkerung, wo der Selektionsdruck für das Entweichen von Antikörpern bereits extrem ist. Tatsächlich wird der größte Teil des Selektionsdrucks nicht durch den Antikörperdruck bestimmt und tritt bei unbehandelten Personen auf, wenn sich das Virus während aufeinanderfolgender Übertragungen weiterentwickelt. Dieser Prozess kann jedoch auch zum Verlust des therapeutischen Potenzials von Antikörpern führen. Nichtsdestotrotz sollte die wiederholte und möglicherweise inkonsistente Anwendung der mAb-Therapie bei chronisch infizierten Personen, die nachweislich über Monate und in einigen Fällen über ein Jahr hinweg Viren in sich tragen, genau überwacht werden, wobei ein Schwerpunkt auf die Einhaltung der Behandlung gelegt werden sollte. Die Möglichkeit, dass das Virus mutiert, sollte uns nicht davon abhalten, klinische Interventionen wie Impfstoffe und Behandlungen einzusetzen, da Interventionen schwere Infektionen verhindern und die Gesamtzahl der Fälle reduzieren – was das Auftreten einer neuen Variante weniger wahrscheinlich macht. Die Analyse der Post-Treatment-Sequenzdatensätze und der möglichen Übertragung von Post-Treatment-emergenten Mutationen wird regelmäßig von der britischen Health Security Agency durchgeführt und online veröffentlicht (https://www.gov.uk/ Government/publications/covid-19-therapeutic -agenten-technische-briefings), um behandlungsbedingte Mutationen schnell zu erkennen und gegebenenfalls zu reagieren.

Obwohl unsere Ergebnisse überzeugend sind, weist unsere Studie mehrere Einschränkungen auf. Wir verwendeten In-vitro-Neutralisationstests und unterschätzen möglicherweise das Neutralisationspotenzial von mAb in vivo, wo die Auswirkungen der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität und des Komplements die Aktivität erhöhen können. Darüber hinaus können wir mithilfe von In-vitro-Systemen nicht feststellen, ob die durch die mAb-Therapie ausgewählten Escape-Mutationen geeignet wären, mit natürlichen Virusvarianten bei natürlichen Infektionen zu konkurrieren. Wir haben uns keine Deep-Sequence-Daten angesehen, um Veränderungen in der Häufigkeit kleinerer Varianten im Laufe der Zeit zu untersuchen. Bei unseren Sequenzen handelt es sich um Konsens-Reads. Unser Einzelaminosäure-Ansatz übersieht möglicherweise kompensatorische Mutationen, die in einer groß angelegten Analyse nicht als signifikant herausgestellt werden, aber bei Patienten wichtig sein können, die bereits eine behandlungsbedingte Substitution entwickelt haben. Zukünftige Forschungen sollten die Dynamik viraler Mutationen innerhalb der Patientenpopulation untersuchen und Längsschnittanalysen verwenden, um niederfrequente Varianten zu identifizieren und die Stärke der Selektion abzuschätzen. Die Verknüpfung mit klinischen Daten wie der Dauer der Infektion und chronischen Immunschwächen wird dabei helfen, die Prädiktoren für Resistenzen zu identifizieren. Viruslasten und klinische Daten lagen uns nicht vor. In dieser Studie wurden keine T-Zellen untersucht, die zur Abwehr des Wirts beitragen und weniger von Mutationen betroffen sind.

Zusammenfassend zeigen wir hier Mutationsveränderungen in Viren, die aus mit mAbs behandelten Patienten isoliert wurden. Die Mutationsprofile von Patienten, die mit Sotrovimab oder REGEN-COV behandelt werden, sind auffallend unterschiedlich und die Mutationen sind den Bindungsstellen für den mAb auf Delta oder BA.1 RBD zugeordnet. Die entsprechenden Mutationen beeinträchtigen die Bindung von mAbs an Spike-RBD, was zu einem verringerten Neutralisationstiter führt. Bemerkenswerterweise entwickeln Viren bei REGEN-COV Mutationspaare, um beiden Komponenten des Antikörpercocktails zu entkommen.

Die Überwachung von Tests und Impfungen zur Coronavirus-Krankheit 2019 (Covid-19) erfolgt gemäß Verordnung 3 der Health Service (Control of Patient Information) Regulations 2002, um vertrauliche Patienteninformationen zu sammeln (www.legislation.gov.uk/uksi/2002/1438/ Regulation/3/made. öffnet in neuem Tab) unter Abschnitt 3(i)(a–c), 3(i)(d) (i) und (ii) und 3. Das Studienprotokoll zur genomischen Überwachung (https:/ /www.gov.uk/ Government/publications/covid-19-genomic-surveillance-of-patients-who-are-treated-with-neutralising-monoclonal-antibody-or-immunsuppressed) wurde einer internen Überprüfung durch die UKHSA unterzogen England Research Ethics and Governance Group und es wurde festgestellt, dass alle regulatorischen Anforderungen vollständig eingehalten werden. Da keine regulatorischen Probleme festgestellt wurden und eine Ethikprüfung für diese Art von Arbeit nicht erforderlich ist, wurde entschieden, dass eine vollständige Ethikprüfung nicht erforderlich wäre. Wir haben weder eine Einverständniserklärung eingeholt noch den Teilnehmern eine Entschädigung gewährt.

Im April 2020 richtete das Vereinigte Königreich ein nationales Programm zur genomischen Überwachung von SARS-CoV-2 ein, mit dem Viren aus einer Zufallsstichprobe positiv getesteter Bevölkerungsgruppen in der Gemeinde und im Krankenhaus routinemäßig sequenziert werden34. Darüber hinaus wurde ein Protokoll eingeführt, um die Sequenzierungsabdeckung derjenigen zu verbessern, die in Krankenhäusern und innerhalb der Gemeinschaft behandelt werden (einschließlich Probenentnahme vor der Behandlung und Nachuntersuchung). Patienten in Behandlung wurden über ihre COG-IDs mit ihren genetischen Sequenzen verknüpft. Die vorliegende Analyse umfasst alle Patienten, die im Vereinigten Königreich behandelt wurden, von denen bis zum 12. April 2022 mindestens eine Probe entnommen wurde und für die eine virale Gensequenz verfügbar war. Da die Datensätze nach der Behandlung bereits klein waren und wir keine geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Virusentwicklung erwarteten, haben wir Geschlecht oder Geschlecht in unserem Studiendesign nicht berücksichtigt und die Patienteninformationen nicht weiter verknüpft, um Alter, Geschlecht oder Geschlecht zu ermitteln.

Zu den fünf therapeutischen Interventionen, die zu diesem Zeitpunkt in der gesamten Bevölkerung eingesetzt wurden, gehörten Casirivimab/Imdevimab, Sotrovimab, Molnupiravir, Remdesivir und Paxlovid (Nirmatrelvir plus Ritonavir). Für jeden Patienten stehen folgende Daten zur Verfügung: Datum der Probe, therapeutischer Eingriff/Behandlung und Datum der Behandlung.

Die Pipeline zur Erfassung und Verarbeitung von SARS-CoV-2-Rohsequenzdaten und probenbezogenen Metadaten im gesamten britischen Genomüberwachungsnetzwerk wurde bereits beschrieben35. Ein Netzwerk von Probenahmestellen (einschließlich Krankenhäusern und Testzentren) produziert Proben und Probenmetadaten. Bei den meisten klinischen Proben handelte es sich um Nasen-/Oropharynxabstriche, es wurden jedoch auch Nasopharynxaspirate, bronchoalveoläre Lavage und Sputumproben entnommen. Einige Probenahmestellen führten ihre eigene Sequenzierung durch; andernfalls wurden sie mit einem regionalen Sequenzierungszentrum oder dem Wellcome Sanger Institut verbunden. Zu den regionalen Sequenzierungszentren gehören akademische Einrichtungen, Labore und öffentliche Gesundheitsbehörden. Die im vorliegenden Manuskript analysierten Sequenzen wurden alle über Säule 1 generiert, was bedeutet, dass sie im gesamten NHS gesammelt und am Probenort oder von einem Universitätslabor für eine schnellere Bearbeitungszeit verarbeitet wurden. Das Sequenzierungszentrum extrahiert und sequenziert Proben. Das genaue Sequenzierungsverfahren war von Standort zu Standort unterschiedlich, die meisten Standorte hielten sich jedoch an das ARTIC-Protokoll (https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bp2l6n26rgqe/v3). entweder Illumina oder die Oxford Nanopore Technologies-Plattform. Die ARTIC-Bioinformatik-Pipeline (https://github.com/connor-lab/ncov2019-artic-nf) wandelt dann SARS-CoV-2-Sequenzierungsdaten in Konsenssequenzen und ein Alignment von Sequenzlesefragmenten um, die auf SARS-CoV-2 ausgerichtet sind Referenzgenom (NCBI NC_045512.2). COVID-Abstammungslinien wurden mit Pango v1.336 zugewiesen.

Alle Sequenzen von Patienten, von denen bekannt ist, dass sie sich einer Behandlung unterzogen haben, wurden von CLIMB heruntergeladen. Genom-Alignments wurden in Genregionen (Spike, nsp5, nsp7, nsp8, nsp9, nsp10, nsp12, nsp14) aufgeteilt und zur Analyse in Aminosäuren übersetzt. Für jede Behandlung wurden Analysen der Proteine ​​durchgeführt, mit denen sie theoretisch interagieren. Die Analysen wurden nach Varianten (Delta, Omicron BA.1 und Omicron BA.2) aufgeteilt, wobei Delta-Unterlinien (B.1617.2 und alle AY-Linien) alle als Delta klassifiziert wurden. Daher wurde jede Analyse unabhängig für jede interessierende Kombination aus Behandlung, Variante und Genregion durchgeführt (Tabelle S1).

Bei Vorbehandlungssequenzen handelt es sich um Sequenzen, die von Patienten mit einer sequenzierten Probe innerhalb einer Woche vor Behandlungsbeginn (einschließlich des Tages des Behandlungsbeginns) erhalten wurden. Die Analyse wurde mit einer Reihe von Grenzwerten zur Definition von Nachbehandlungssequenzen wiederholt, einschließlich Nachbehandlungssequenzen nur dann, wenn sie mindestens 1, 5, 10 oder 14 Tage nach der Behandlung beprobt wurden. Unsere Hauptanalyse verwendet den 10-Tage-Cutoff und 1, 5 und 14 Tage werden als Sensitivitätsanalyse dargestellt. Für jede Analyse teilen wir den Datensatz in Sequenzen vor und nach der Behandlung auf. An jeder Stelle im Alignment wurde die Aminosäurehäufigkeit in den Sequenzen vor und nach der Behandlung berechnet und der exakte Fisher-Test wurde verwendet, um zu bestimmen, ob diese Wahrscheinlichkeitsverteilung von der Nullerwartung abweicht. Auf diese Weise wurden Stellen identifiziert, die unerwartete Unterschiede in der Aminosäurehäufigkeit aufweisen, und die spezifischen Aminosäureveränderungen hervorgehoben. Die Analysen wurden auf Patientenebene und nicht auf Sequenzebene durchgeführt, sodass, wenn ein Patient mehrere Sequenzen vor oder nach der Behandlung aufwies, eine einzige Sequenz beibehalten wurde, wobei vom Wildtyp abweichende Sequenzen bevorzugt wurden.

Alle Delta- (n = 763.511), BA.1- (n = 742.992) und BA.2- (n = 407.161) Sequenzen ab September 2021 wurden von CLIMB heruntergeladen, in Aminosäuren übersetzt und mithilfe eines hauseigenen Skripts in Proteine ​​aufgespalten. Für jede in unserer Analyse identifizierte Aminosäurestelle wurden die Aminosäurehäufigkeiten tabellarisch aufgeführt und als Anteile an der Gesamtzahl der Sequenzen mit einer lesbaren Aminosäure berechnet.

Strukturmodelle von RBD-mAbs-Komplexen wurden durch Überlagerung von 7ORB [https://www.rcsb.org/structure/7ORB] (RBD mit L452R) und Omicron RBD (7TLY [https://www.rcsb.org/structure) erstellt /7TLY]) mit Komplexen von RBD-Casirivimab/Imdevimab (6XDG [https://www.rcsb.org/structure/6XDG]) und RBD-sotrovimab (7BEP [https://www.rcsb.org/structure/7BEP ]), wobei das Programm SHP37 zum Ausrichten der RBD-Domänen verwendet wird. Modelle von 7ORB [https://www.rcsb.org/structure/7ORB] RBD, angedockt mit Casirivimab/Imdevimab, und Omicron RBD, angedockt mit Sotrovimab, wurden extrahiert und an Arzneimittelinteraktionsstellen mit Coot38 analysiert. Molekulare Grafikbilder wurden mit UCSF ChimeraX39 erstellt.

Pfizer-Impfstoffserum wurde von Freiwilligen gewonnen, die drei Dosen des BNT162b2-Impfstoffs (Pfizer/BioNTech) erhalten hatten. Bei den geimpften Personen handelte es sich um Mitarbeiter des Gesundheitswesens des Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, bei denen keine vorherige Infektion mit SARS-CoV-2 bekannt war und die in die OPTIC-Studie als Teil der Oxford Translational Gastrointestinal Unit GI Biobank Study 16/YH/0247 aufgenommen wurden [Forschungsethikkommission (REC) in Yorkshire & The Humber – Sheffield], die am 8. Juni 2020 zu diesem Zweck geändert wurde. Die Studie wurde gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki (2008) und der Internationalen Harmonisierungskonferenz durchgeführt ( ICH) Good Clinical Practice (GCP)-Richtlinien. Für alle an der Studie teilnehmenden Teilnehmer wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Den Teilnehmern wurden etwa 28 Tage (Median 31, Bereich 28–56) Proben entnommen, nachdem sie eine dritte Auffrischungsdosis des mRNA-Impfstoffs Pfizer/BioNtech BNT162b2, 30 Mikrogramm, intramuskulär nach Verdünnung (jeweils 0,3 ml) im Abstand von 17–28 Tagen erhalten hatten 1 und 2, dann etwa 9 Monate Abstand (Bereich 253–300) für Dosis 2 und 3. Das Durchschnittsalter der Geimpften betrug 42 Jahre (Bereich 30–59), 10 Männer und 9 Frauen.

Pseudotypisierte Lentiviren, die SARS-CoV-2-Spike-Proteine ​​für Vorfahrenstämme (Victoria, Delta und BA.1) exprimieren, wurden wie zuvor beschrieben29,40 mit einigen Modifikationen konstruiert. Eine ähnliche Strategie wurde für alle Variantenkonstrukte angewendet. Delta und BA.1 wurden als Matrize verwendet und die Konstrukte wurden durch PCR-Amplifikation des Vektors und der Inserts geklont, gefolgt von der Gibson-Assemblierung. Um die Insert-Fragmente zu erzeugen, wurden die überlappenden Primer für alle einzelnen Varianten separat zur Amplifikation verwendet, zusammen mit zwei Primern des pcDNA3.1-Vektors (pcDNA3.1_BamHI_F und pcDNA3.1_Tag_S_EcoRI_R). Der pcDNA3.1-Vektor wurde auch mit den Primern pcDNA3.1_Tag_S_EcoRI_F und pcDNA3.1_BamHI_R amplifiziert. Die in dieser Studie verwendeten Primerpaare sind in der Ergänzung aufgeführt (Tabelle S2). Alle Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung nach Plasmidisolierung mit dem QIAGEN Miniprep Kit (QIAGEN) verifiziert. Die resultierende, das Spike-Gen tragende pcDNA3.1 wurde zur Erzeugung pseudoviraler Partikel zusammen mit dem lentiviralen Verpackungsvektor und dem Transfervektor, der den Luciferase-Reporter kodiert, verwendet.

Die Einzelheiten des pseudoviralen Neutralisationstests wurden mit einigen Änderungen bereits zuvor beschrieben19,40. Kurz gesagt, eine vierfache Reihenverdünnung jedes mAb, beginnend mit 10 µg/ml, wurde mit pseudoviralen Partikeln 1 Stunde lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die stabilen HEK293T/17-Zellen (ATCC, CRL-11268), die menschliches ACE2 exprimieren, wurden dann mit 1,5 × 104 Zellen/Vertiefung zu der Mischung gegeben. 48 Stunden nach der Transduktion wurden die Kulturüberstände entfernt und 50 µl des 1:2 Bright-GloTM Luciferase-Assaysystems (Promega, USA) in 1x PBS in jede Vertiefung gegeben. Die Reaktion wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde mit CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Deutschland) gemessen. Der Prozentsatz der Neutralisierung wurde relativ zur Kontrolle berechnet. Mithilfe der Probit-Analyse wurde der Wert der Verdünnung abgeschätzt, der die Hälfte der maximalen pseudotypisierten Lentivirus-Infektion (PVNT50) hemmt. In die Studie einbezogene Antikörper waren Imdevimab (Regeneron), Casirivimab (Regeneron) und Sotrovimab (GSK). Um die neutralisierende Aktivität von Impfstoffseren zu bestimmen, wurden dreifache Reihenverdünnungen ausgehend von reinen Proben eine Stunde lang mit pseudoviralen Partikeln inkubiert und die gleiche Strategie wie bei mAb angewendet. Die zur Erzeugung von Pseudoviren verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle S2 aufgeführt.

Um das His-markierte Konstrukt von RBDs zu erzeugen, wurde eine ortsgerichtete PCR-Mutagenese unter Verwendung des Delta- oder BA.1-Pseudovirus-Plasmidkonstrukts als Matrize durchgeführt, oder ein Pseudovirus-Plasmidkonstrukt, das die gewünschte RBD-Mutante enthielt, wurde als Matrize für die Amplifikation des RBD verwendet Genfragment.

Die für die Klonierung jedes RBD verwendeten Matrizen, Primer und Expressionsvektoren sind in Tabelle S3 und die Primersequenzen in Tabelle S4 aufgeführt.

Das Klonen wurde mit dem ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme) durchgeführt. Die Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung nach Plasmidisolierung mit dem QIAGEN Miniprep Kit (QIAGEN) verifiziert.

Plasmide, die für RBDs kodieren, wurden durch PEI in Expi293F™-Zellen (Gibco, A14527) transfiziert und 3 Tage lang in FreeStyle™ 293 Expression Medium (ThermoFisher) bei 30 °C mit 8 % CO2 kultiviert. Das konditionierte Medium wurde 1:2 in Bindungspuffer (50 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 8,0) verdünnt. RBDs wurden mit einer 5-ml-HisTrap-Nickelsäule (GE Healthcare) durch His-Tag-Bindung gereinigt, gefolgt von einer Superdex 75 10/300 GL-Gelfiltrationssäule (GE Healthcare) in 10 mM HEPES und 150 mM Natriumchlorid.

Die Oberflächenplasmonresonanzexperimente wurden mit einem Biacore T200 (GE Healthcare) durchgeführt. Alle Tests wurden mit einem Laufpuffer von HBS-EP (Cytiva) bei 25 °C durchgeführt. Es wurde ein Protein-A-Sensorchip (Cytiva) verwendet. Der mAb wurde wie angegeben auf der Probenflusszelle des Sensorchips immobilisiert. Die Referenzfließzelle wurde leer gelassen.

Um die Bindungskinetik zu bestimmen, wurde RBD in einem Bereich von fünf Konzentrationen, die durch serielle Zweifachverdünnungen hergestellt wurden, mit einer Flussrate von 30 μl min-1 unter Verwendung eines Einzelzyklus-Kinetikprogramms über die beiden Durchflusszellen injiziert. Mit demselben Programm wurde auch Laufpuffer zur Hintergrundsubtraktion eingefügt. Alle Daten wurden mit der Biacore T200 Evaluation Software 3.1 an ein 1:1-Bindungsmodell angepasst. Um die Bindungsaffinität zu bestimmen (wobei die Kinetik schwierig zu bestimmen war), wurde RBD in einem Konzentrationsbereich, der durch serielle Zweifachverdünnungen hergestellt wurde, mit einer Flussrate von 30 μl/min über die beiden Durchflusszellen injiziert. Mit demselben Programm wurde auch Laufpuffer zur Hintergrundsubtraktion eingefügt. Alle KD-Daten wurden mit der Biacore T200 Evaluation Software 3.1 an ein 1:1-Bindungsmodell angepasst; Die Zahlen wurden mit GraphPad Prism 9 aufgezeichnet.

Um die Bindungsprofile zwischen Delta RBD + G446V / Delta RBD + G446V + Y453F/Delta RBD + G446V + L455F und Delta RBD WT für Imdevimab zu vergleichen, wurde eine einzelne RBD-Injektion über die beiden Durchflusszellen bei 1 μM in einem Durchfluss durchgeführt Rate von 30 μl min−1. Mit demselben Programm wurde auch Laufpuffer zur Hintergrundsubtraktion eingefügt. Die Sensorgramme wurden mit Prism9 (GraphPad) aufgezeichnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie erzeugten Reagenzien sind bei David Stuart mit einer ausgefüllten Materialtransfervereinbarung erhältlich. Die in dieser Studie generierten SARS-CoV-2-Genomdaten wurden in der Genbank hinterlegt. Die Liste der IDs finden Sie in den Zusatzdaten 1. Die Quelldaten für alle Abbildungen werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Informationen zu klinischen Behandlungen auf individueller Ebene, die mit der Sequenz-ID verknüpft sind, sind aus Gründen der Patientenvertraulichkeit nur eingeschränkt zugänglich, aber Einzelpersonen können Zugang erhalten, indem sie einen angemessenen Forschungsvorschlag einreichen, der an Meera Chand [email protected] und gesendet wird Unterzeichnung einer Vereinbarung zur Datenweitergabe.

Die Analyse wurde mithilfe einer Reihe von Skripten durchgeführt, die auf Github verfügbar sind (https://github.com/manonr/covid-therapeutics). Ein permanenter Link zur Version des in dieser Studie verwendeten Codes ist unter https://github.com/manonr/covid-therapeutics/releases/tag/v.1.0-2023-01 verfügbar.

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Wir danken Andrew Balmer für die Untersuchung der Rohdaten, um den Zusammenhang zwischen Mutationen zu bestätigen, sowie dem gesamten Genomics Public Health Analysis-Team und dem COVID-19-Therapieprogramm der UK Health Security Agency. Wir danken allen Teams, die an der Probenahme, Sequenzierung und Verarbeitung von SARS-CoV-2-Viren und -Sequenzen beteiligt sind. Wir danken allen Freiwilligen, die für die Studie Blut gespendet haben. Diese Arbeit wurde vom Innovation Fund for Medical Science (CIFMS) der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (CAMS), China (Fördernummer: 2018-I2M-2-002) an DIS und GRS unterstützt. Wir sind auch dankbar für die Unterstützung durch die Red Avenue Foundation und die Oak Foundation. GRS und J.Ren werden vom Wellcome Trust (101122/Z/13/Z), DIS und EEF vom UKRI MRC (MR/N00065X/1) unterstützt. DIS, SJD und GRS sind Jenner-Ermittler. PK ist NIHR Senior Investigator und wird von Wellcome (WT109965MA) unterstützt. SJD wird von einer NIHR Global Research Professorship (NIHR300791) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch vom britischen Ministerium für Gesundheit und Soziales im Rahmen des PITCH-Konsortiums (Protective Immunity from T Cells to Covid-19 in Health Workers) und UKRI ( MR/W02067X/1), mit Beiträgen von UKRI/NIHR über das UK Coronavirus Immunology Consortium (UK-CIC), die Huo Family Foundation und das National Institute for Health Research (UKRIDHSC COVID-19 Rapid Response Rolling Call, Grant Reference Number COV19). -RECPLAS). Wir danken den Mitarbeitern der MRC Human Immunology Unit für den Zugang zu ihrer Biacore-Einrichtung. Wir bedanken uns für die gemeinsame Finanzierung des Zentrums durch den UK Medical Research Council und das Department for International Development (MR/R015600/1). Diese Arbeit wird auch vom National Institute for Health Research Health Protection Research Unit in Modeling Methodology, der Abdul Latif Jameel Foundation und dem von der Europäischen Union unterstützten EDCTP2-Programm unterstützt.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Manon Ragonnet-Cronin, Rungtiwa Nutalai, Jiandong Huo, Aiste Dijokaite-Guraliuc, Gavin R. Screaton, Sakib Rokadiya.

Genomics Public Health Analysis, UK Health Security Agency, London, Großbritannien

Manon Ragonnet-Cronin, Natalie Groves, Hassan Hartman, Nicholas Ellaby, J. Mark Sutton, Colin Brown, Susan Hopkins, Meera Chand und Sakib Rokadiya

Zentrum für globale Analyse von Infektionskrankheiten, Imperial College London, London, England

Von Manon Ragonnet-Cron

Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Rungtiwa Nutalai, Aiste Dijokaite-Guraliuc, Raksha Das, Aekkachai Tuekprakhon, Piyada Supasa, Chang Liu, Muneeswaran Selvaraj, Juthathip Mongkolsapaya und Gavin R. Screaton

Abteilung für Strukturbiologie, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, The Wellcome Centre for Human Genetics, Oxford, Großbritannien

Jiandong Huo, Mohammad W. Bahar, Daming Zhou, Elizabeth Fry, Jingshan Ren und David I. Stuart

Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften (CAMS) Oxford Institute (COI), Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Chang Liu & Daming Zhou

Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Paul Klenerman und Susanna J. Dunachie

Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford, Großbritannien

Paul Klenerman und Susanna J. Dunachie

Abteilung für translationale Gastroenterologie, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Paul Klenerman

NIHR Oxford Biomedical Research Centre, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Paul Klenerman und Susanna J. Dunachie

Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Bangkok, Thailand, Department of Medicine, University of Oxford, Oxford, Großbritannien

Juthathip Mongkolsapaya

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MRC, SR, GRS und DIS haben die Studie konzipiert. MRC führte die Nachbehandlungsanalysen durch. NG führte die genomischen Überwachungsanalysen im Vereinigten Königreich durch. RN, AD-G., RD, AT, PS, CL, MS, DZ und JH führten Experimente durch, JH, JM, MC entwarfen Experimente, PK und SJD überwachten die OPTIC-Studie zur Sammlung von Impfserum als Teil des PITCH Konsortium. MB, JR, EF und DIS führten Strukturanalysen durch. NG, HH, NE, MS, CB, SH und SR analysierten Sequenzdaten. MRC, GRS, JH und DIS haben den ersten Entwurf des Manuskripts geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Manon Ragonnet-Cronin, Jiandong Huo, David I. Stuart, Gavin R. Screaton oder Sakib Rokadiya.

GRS sitzt im wissenschaftlichen Beirat von GSK Vaccines, berät Astra Zeneca und ist Gründungsmitglied von RQ Biotechnology. DIS berät Astra Zeneca. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Anmol Chandele und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ragonnet-Cronin, M., Nutalai, R., Huo, J. et al. Erzeugung von SARS-CoV-2-Escape-Mutationen durch monoklonale Antikörpertherapie. Nat Commun 14, 3334 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37826-w

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Eingegangen: 06. Oktober 2022

Angenommen: 03. April 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37826-w

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