Epigenetische Stummschaltung durch den SMC5/6-Komplex vermittelt HIV

Sep 15, 2023

Nature Microbiology Band 7, Seiten 2101–2113 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Nach dem Viruseintritt und der umgekehrten Transkription werden HIV-1-Proviren, die sich nicht integrieren können, epigenetisch zum Schweigen gebracht, der zugrunde liegende Mechanismus ist jedoch weiterhin unklar. Mithilfe eines genomweiten CRISPR/Cas9-Knockout-Screenings identifizierten wir den SMC5/6-Komplex des Wirts als wesentlich für diese epigenetische Stummschaltung. Wir zeigen, dass SMC5/6 an nicht integrierte chromatinisierte HIV-1-DNA bindet und diese dann SUMOyliert. Die Hemmung der SUMOylierung, entweder durch Punktmutagenese der SMC5/6-Komponente NSMCE2 – einer SUMO E3-Ligase – oder durch die Verwendung des SUMOylierungsinhibitors TAK-981, verhindert epigenetische Stummschaltung, ermöglicht die Transkription von nicht integrierter HIV-1-DNA und rettet die Replikation von Integrase-defizienten HIV-1. Schließlich zeigen wir, dass die Blockierung der Expression des SMC5/6-Komplexes oder die Hemmung seiner SUMOylierungsaktivität die Etablierung latenter HIV-1-Infektionen sowohl in CD4+-T-Zelllinien als auch in primären menschlichen T-Zellen unterdrückt. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass der SMC5/6-Komplex eine direkte Rolle bei der Vermittlung der Etablierung der HIV-1-Latenz spielt, indem er Integrations-kompetente HIV-1-Proviren vor der Integration epigenetisch zum Schweigen bringt.

Die Integration proviraler DNA in das Genom der Wirtszelle ist ein entscheidendes Merkmal des retroviralen Lebenszyklus, das für die provirale Transkription und Replikation wesentlich ist1,2. Integrase (IN)-Inhibitoren hemmen wirksam die HIV-1-Replikation3. In Abwesenheit von funktionellem IN akkumulieren nicht integrierte HIV-1-Proviren repressive epigenetische Markierungen, einschließlich der Trimethylierung von Lysin 9 auf Histon H3 (H3K9me3), und weisen keine aktivierenden Markierungen wie die H3-Acetylierung (H3Ac) auf4,5. Während die epigenetische Stummschaltung der Transkription von nicht integrierter HIV-1-DNA wahrscheinlich eine Wirtsabwehr gegen fremde DNA darstellt, sind die zugrunde liegenden Mechanismen und zellulären Faktoren, die diesen Effekt vermitteln, noch unvollständig definiert6,7.

Beim murinen Leukämievirus (MLV) identifizierte ein genomisches Screening Komponenten des HUSH-Komplexes (Human Silencing Hub) sowie das DNA-bindende Protein NP220 als entscheidend für die nicht integrierte MLV-DNA-Stummschaltung8. Nachfolgende Arbeiten9,10 konnten jedoch keine Rolle des HUSH-Komplexes oder von NP220 bei der Stummschaltung von nicht integriertem HIV-1 nachweisen. Kürzlich wurde bei einem Screening von 1.217 menschlichen Genen, bei denen festgestellt wurde, dass sie durch das HIV-1-Vpr-Protein herunterreguliert werden, eine Komponente der strukturellen Aufrechterhaltung des Chromosom (SMC) 5/6-Komplexes, der SMC5/6-Komplex-Lokalisierungsfaktor 2 (SLF2), als kritisch identifiziert zur Stummschaltung nicht integrierter HIV-1-DNA. Dieses Screening zeigte auch, dass sechs weitere Komponenten des SMC5/6-Komplexes, darunter SMC5 und 6, sowie die vier SMC5/6-assoziierten Proteine, die nichtstrukturelle Aufrechterhaltung der Chromosomenelement 1 bis 4 (NSMCE1–4), nicht jedoch SMC5/6. 6-assoziierter Faktor SLF1 waren auch entscheidend für die epigenetische Stummschaltung nicht integrierter HIV-1-DNA9. Bemerkenswert ist, dass zuvor gezeigt wurde, dass der SMC5/6-Komplex durch das Nichtstrukturprotein HBX des Hepatitis-B-Virus (HBV) abgebaut wird und in Abwesenheit von HBX auch episomale HBV-DNA epigenetisch stummgeschaltet wird11,12. Somit ist der SMC5/6-Komplex nicht nur an der chromosomalen Replikation, Rekombination und Reparatur beteiligt13, sondern kann auch invasive virale DNA zum Schweigen bringen. Hier wollten wir herausfinden, ob der SMC5/6-Komplex die Entstehung latenter HIV-1-Infektionen vermittelt.

Um Faktoren zu identifizieren, die nicht integrierte HIV-1-DNA transkriptionell zum Schweigen bringen, führten wir ein genomweites CRISPR/Cas9-Knockout-Screening14 in der menschlichen CD4+-T-Zelllinie CEM-SS durch. Wir haben einen CEM-SS-Subklon, der Streptococcus pyogenes Cas9 exprimiert, mit einer lentiviralen Bibliothek transduziert, die etwa 80.000 Single Guide RNAs (sgRNAs) exprimiert, die auf 19.114 menschliche Gene abzielen15. Sieben Tage später infizierten wir diese Zellen mit IN− NL-GFPΔEnv10, einem HIV-1-Derivat, das eine Deletion in env, die inaktivierende D64V-Mutation16 in IN und den offenen Leserahmen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) anstelle von nef enthält. Dieses Virus behält intakte Kopien der anderen sechs HIV-1-Gene, einschließlich vpr. 48 Stunden nach der Infektion (hpi) wurden GFP+-Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) gesammelt, die sgRNAs durch PCR (Polymerasekettenreaktion) gewonnen und dann in denselben lentiviralen Vektor kloniert. Nach drei Selektionsrunden für GFP+-Zellen wurden die sgRNAs sequenziert und auf Anreicherung im Vergleich zur Ausgangs-sgRNA-Bibliothek analysiert. Wie im Vulkandiagramm in Abb. 1a gezeigt, identifizierten wir 9 Gene, die >16-fach angereichert waren und einen P-Wert <0,0005 hatten. Dazu gehörten drei Zelloberflächenrezeptoren (LY9, OR52N2 und SSTR2) und ein Motorprotein (MYO1B), die nicht weiter analysiert wurden. Diese Analyse ergab auch vier der acht bekannten Komponenten des SMC5/6-Komplexes, nämlich SMC5, SMC6, SLF1 und NSMCE3, sowie das DNA-Reparaturprotein SWI5 (Abb. 1a).

a, Vulkandiagramm der mittleren Faltungsänderung von sgRNAs, die für jedes Gen spezifisch sind, und ihrer durch die falsche Entdeckungsrate (FDR) korrigierten P-Werte. Gene mit Fold Change >16 und P-Wert <0,0005 (durch die roten Linien abgegrenzt) sind gekennzeichnet. Kurz gesagt, die P-Werte für einzelne sgRNAs wurden unter Verwendung eines negativen Binomialmodells (NB) berechnet. Anschließend wurden sortierte sgRNA-P-Werte verwendet, um FDR-korrigierte P-Werte für einzelne Gene unter Verwendung des robusten Rangaggregationsalgorithmus (αRRA) in MAGeCK-VISPR50,51 zu berechnen . Mitglieder des SMC5/6-Komplexes sind grün (FDR-korrigierte P-Werte: SMC5 = 7,8 × 10−7, SMC6 = 0,00033, NSMCE3 = 0,00010, SLF1 = 0,00017). b, Durchflusszytometrie von WT-CEM-SS-Zellen und den angegebenen klonalen Knockout-Zelllinien bei 2 dpi mit einem IN− NL-GFPΔEnv-Reportervirus bei einer MOI von ~0,3. Gezeigt wird ein repräsentatives Experiment aus 3 biologischen Replikaten. c,d, Durchflusszytometrie von WT- (c) oder ΔSMC5 CEM-SS-Zellen (d) bei 2 dpi mit IN+ NL-GFPΔEnv-Reportervirus bei einer MOI von ~0,3. Es werden repräsentative Experimente aus drei biologischen Replikaten gezeigt. e–h, Zeitlicher Verlauf der Infektion der Eltern-CEM-SS-Cas9-Zellen oder der ∆SMC5- und ∆SLF2-CEM-SS-Klone mit IN+ oder IN− NL-NLuc. e, lebende Zellen. f, viral kodierter NLuc-Ausdruck. g, Gesamt-HIV-1-DNA. h, Gesamt-HIV-1-RNA-Expression, quantifiziert mit dem angegebenen dpi. Alle IN+ HIV-1-infizierten Kulturen starben bei 7 dpi an viraler Zytopathizität. Die DNA- und RNA-Spiegel wurden durch qPCR quantifiziert und auf IN+ HIV-1-infizierte CEM-SS Cas9-Zellen bei 1 dpi normalisiert, was auf 1 eingestellt war. Mittelwert ± Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten.

Quelldaten

Um die Bedeutung dieser fünf Proteine ​​sowie der anderen vier bekannten SMC5/6-Komplexkomponenten (NSMCE1, 2 und 4 und SLF2) zu bestätigen, haben wir ihre Expression in CEM-SS Cas9-Zellen mithilfe zweier unabhängiger sgRNAs gehemmt (Extended Data Abb . 1). Der Abbau einer der acht SMC5/6-Komponenten steigerte die GFP-Expression aus dem IN-NL-GFPΔEnv-Vektor erheblich. Da der Abbau von SWI5 keine Wirkung hatte, wurde dieses Gen als falsch positiv angesehen.

Als nächstes generierten wir klonale Knockout-Zelllinien in CEM-SS-Zellen für SMC5, SMC6, NSMCE2, NSMCE4, SLF1 und SLF2. Mit Ausnahme von NSMCE2 haben wir in jedem Fall zwei unabhängige Knockout-Zelllinien generiert, um mögliche klonale Variationen zu vermeiden. Diese Gen-Knockouts wurden durch Identifizierung inaktivierender Frameshift-Mutationen durch DNA-Sequenzierung (Ergänzungstabelle 1) und Western Blot (Erweiterte Daten, Abb. 2) verifiziert. Die mutierten Zellen zeigten die gleiche Wachstumskinetik wie Wildtyp (WT) CEM-SS-Zellen (Extended Data Abb. 3). Die Infektion dieser Zelllinien mit dem Reporter IN− NL-NLucΔEnv, bei dem GFP durch Nano-Luciferase (NLuc)10 ersetzt wurde, ergab eine teilweise Wiederherstellung der NLuc-Expression aus nicht integrierter HIV-1-DNA (Extended Data, Abb. 3d). Darüber hinaus ergab die Infektion dieser Knockout-Klone mit dem IN− NL-GFPΔEnv-Virus bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von ~ 0,3 eine ähnliche Menge an GFP+-Zellen (von 29 % bis 43 % positiv, Abb. 1b) wie im WT CEM-SS-Zellen infiziert mit einer IN+-Form von NL-GFPΔEnv (32 % positiv, Abb. 1c), obwohl das IN+-Virus eine höhere mittlere Fluoreszenzintensität induzierte. Die Infektion von ΔSMC5 CEM-SS-Zellen mit der IN+-Form von NL-GFPΔEnv ergab viel mehr GFP+-Zellen im Vergleich zu WT-CEM-SS-Zellen (Abb. 1c vs. 1d). Da die provirale Integration von HIV-1 ineffizient ist17, nehmen wir an, dass dieser Anstieg auf die Transkription nicht integrierter IN+ HIV-1-DNA zurückzuführen ist. Die Infektion von WT-CEM-SS-Zellen mit dem IN− NL-GFPΔEnv-Virus erzeugte keine GFP+-Zellen (Abb. 1b).

Wir fragten uns, ob Zellen, denen die Funktion des SMC5/6-Komplexes fehlt, die Replikation von IN-HIV-1 unterstützen würden. Wie in Abb. 1e–h gezeigt, führte IN− HIV-1 mit der inaktivierenden D64V-Integrase-Mutation tatsächlich zu Ausbreitungsinfektionen in den ΔSMC5- und ΔSLF2-Subklonen und erreichte 14 Tage nach der Infektion (dpi) erhebliche Mengen an viraler DNA, RNA und Proteinexpression. wenn es in Gegenwart von Raltegravir gezüchtet wird, um jegliche Revertantenmutationen zu verhindern. In WT-CEM-SS-Zellen wurde keine Replikation von IN-HIV-1 beobachtet (Abb. 1f – h). Die IN− HIV-1-Replikation in Zellen ohne funktionelle SMC5/6-Komplexe verursachte eine virale Zytopathie, die die gesamte Kultur um 16 dpi abtötete (Abb. 1e). Wichtig ist, dass bei 14 dpi die inaktivierende D64V IN-Mutation vollständig erhalten blieb. Darüber hinaus wurden in Kulturen, die sowohl mit dem IN+- als auch mit dem IN−-Virus infiziert waren, zwei lange terminale Wiederholungskreise (2LTR) nachgewiesen, die für nicht integrierte HIV-1-DNA charakteristisch sind, während integriertes HIV-1 durch Quantifizierung der Integrationen in Alu-Wiederholungsregionen im Genom durch Alu- nachgewiesen wurde. basierte quantitative PCR (Alu-qPCR)18 war nur im ersteren vorhanden (Extended Data Abb. 3b, c). Obwohl die Replikation von IN− HIV-1 in Zellen ohne SMC5/6-Komplex sicherlich langsamer ist als die von IN+ HIV-1 (Abb. 1f – h), ist es bemerkenswert, dass sich IN− HIV-1 überhaupt replizieren kann.

Die epigenetische Unterdrückung nicht integrierter HIV-1-DNA korreliert mit der Hinzufügung der repressiven Histonmodifikation H3K9me3 und dem Verlust der aktivierenden Modifikationen H3Ac und H3K4me34,10. Wir haben daher getestet, ob der Verlust des SMC5/6-Komplexes eine epigenetische Stummschaltung verhindern würde. Die Analyse der Zugabe der aktivierenden H3Ac- und H3K4me3-Modifikationen zu nicht integrierter IN− HIV-1-DNA ergab ein ähnliches Niveau wie bei IN+ HIV-1 in den ΔSMC5- und ΔSLF2-Subklonen (Extended Data Abb. 4a,b). In ähnlicher Weise zeigten Zellen, denen der SMC5/6-Komplex fehlte, verlorene inhibitorische H3K9me3-Modifikationen auf nicht integrierter HIV-1-DNA (Extended Data Abb. 4c). Im Gegensatz dazu wurden weder das Ausmaß der gesamten Histon-H3-Bindung an virale DNA (Extended Data Abb. 4d) noch das Ausmaß von H3K27me3 (Extended Data Abb. 4e) nennenswert beeinflusst.

Obwohl berichtet wurde, dass das HIV-1-Vpr-Protein die Genexpression von nicht integrierter HIV-1-DNA9,19 steigert und die SMC5/6-Komponente SLF29 abbaut, haben wir zuvor berichtet, dass die Vpr-Überexpression die Genexpression von IN− HIV-110 nicht steigert. und WT-Vpr+-Viren werden durch Integrase-Inhibitoren stark gehemmt3. Um die Wirkung von Vpr auf die nicht integrierte virale Genexpression zu testen, infizierten wir WT- oder ΔSMC5-CEM-SS-Zellen mit dem IN− NL-GFPΔEnv-Virus ± Vpr und sahen keinen erkennbaren Unterschied (Extended Data Abb. 5).

Der SMC5/6-Komplex SUMOyliert mehrere Proteinsubstrate, darunter sich selbst13, über die SUMO-E3-Ligase NSMCE220,21. Die durch die DNA-Bindung stimulierte SUMOylierungsaktivität22 ist für die Rolle des SMC5/6-Komplexes bei der DNA-Reparatur und -Rekombination13 von wesentlicher Bedeutung. Mehrere Chromatinkomponenten, einschließlich Histon H4, können SUMOyliert werden, und die Histon-SUMOylierung ist mit einer Transkriptionsrepression verbunden23,24. Um festzustellen, ob die Chromatin-SUMOylierung durch SMC5/6 zur epigenetischen Stummschaltung nicht integrierter HIV-1-DNA beiträgt, haben wir NSMCE2 in CEM-SS-Zellen ausgeschaltet, was durch DNA-Sequenzierung (Ergänzungstabelle 1) und Western Blot (Erweiterte Daten, Abb. 2) bestätigt wurde. . Der Verlust von NSMCE2 rettete die GFP-Expression des IN-NL-GFPΔEnv-Virus. Diese Rettung wurde durch die ektopische Expression von WT NSMCE2 blockiert, nicht jedoch durch die NSMCE2ΔSUMO-Mutante, der aufgrund von C185S/H187Q-Mutationen, die in die essentielle RING-Fingerdomäne eingeführt wurden, die SUMOylierungsaktivität fehlt (Abb. 2a). Ein ähnliches Ergebnis wurde mit dem IN− NL-NLucΔEnv-Reportervirus beobachtet, da der Verlust der NSMCE2-Expression im ΔNSMCE2-Subklon die NLuc-Expression aus nicht integrierter HIV-1-DNA rettete und diese Rettung durch die Expression von WT, aber nicht durch mutiertes NSMCE2 blockiert wurde (Abb. 2b). ). Dies war nicht auf die Instabilität der NSMCE2ΔSUMO-Mutante zurückzuführen (Abb. 2c). Darüber hinaus hemmten sowohl die WT- als auch die ΔSUMO-Form von NSMCE2 nicht integrierte HIV-1-DNA und der Verlust der NSMCE2-Expression nicht die Rekrutierung der SMC5-Komponente des SMC5/6-Komplexes in virale DNA (Abb. 2d). Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) – qPCR unter Verwendung eines für SUMO2/3 spezifischen Antikörpers in WT-CEM-SS-, ΔNSMCE2- und ΔSMC5-Zellen, die mit IN− NL-GFP infiziert waren, konnte die SUMO-Modifikation auf nicht integrierter chromatinisierter HIV-1-DNA in WT-Zellen leicht erkennen, jedoch nicht in Zellen, denen entweder NSMCE2 oder SMC5 fehlten und die Hintergrundniveaus der Antikörperbindung zeigten (Abb. 2d, e).

a, Durchflusszytometrie bei 2 dpi von WT- oder ∆NSMCE-CEM-SS-T-Zellen, transduziert mit einem lentiviralen Vektor, der nichts exprimiert, FLAG-NSMCE2 oder der FLAG-NSMCE2∆SUMO-Mutante, und dann mit IN− NL-GFPΔEnv bei einer MOI von ~ infiziert 0,3. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment aus 3 biologischen Replikaten. b, Quantifizierung der viral kodierten NLuc-Expression in den angegebenen Zellen, die mit IN+ oder IN− NL-NLucΔEnv infiziert sind. Die NLuc-Expression wurde auf die IN− HIV-1-Infektion von WT-CEM-SS-Zellen normalisiert, die auf 1 gesetzt wurde (**P = 0,0010, ***P = 0,0009, ****P < 0,0001, 1-Wege-Analyse der Varianz (ANOVA, Dunnett-Test). c, Repräsentativer Western Blot von FLAG-markiertem WT FLAG-NSMCE und der NSMCE2∆SUMO-Expression nach Transduktion der angegebenen Zelltypen. d, ChIP-qPCR-Quantifizierung der Menge an gebundenem, ektopisch exprimiertem FLAG-markiertem NSMCE2 oder endogenem SMC5 an nicht integrierte IN− HIV-1-DNA in WT- oder ∆NSMCE-CEM-SS-T-Zellen. Die SUMO2/3-Ablagerung wurde auch durch ChIP-qPCR bestimmt (ΔNSMCE2 + NSMCE2 ***P = 0,0002, ΔNSMCE2 + NSMCE2ΔSUMO ***P = 0,0003; 2-Wege-ANOVA, Dunnett-Test). e, Quantifizierung des Ausmaßes der SUMO2/3-Ablagerung auf dem HIV-1-LTR bei 2 dpi in WT- und ∆SMC5-CEM-SS-Zellen, die mit IN− NL-GFPΔEnv infiziert sind. IgG diente als Negativkontrolle (****P < 0,0001, 2-Wege-ANOVA, Sidaks Test). Die Daten in b, d und e sind Mittelwerte ± Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten.

Quelldaten

Wenn die Chromatin-SUMOylierung für die epigenetische Stummschaltung nicht integrierter HIV-1-DNA von entscheidender Bedeutung ist, dann sollten Medikamente, die die SUMOylierung hemmen, die Genexpression durch IN-HIV-1 retten. Das Krebsmedikament TAK-981 ist ein spezifischer Inhibitor des SUMO-aktivierenden Enzyms, das den ersten Schritt der Protein-SUMOylierung katalysiert26. Wir führten ein TAK-981-Dosis-Wirkungs-Experiment in WT-CEM-SS-Zellen sowie im ΔSMC5-Subklon nach Infektion mit dem IN− NL-NLucΔEnv-Reporter durch. TAK-981-Spiegel von 5 nM bis 1.000 nM wurden bei 0 dpi zugegeben, die Zellen lysiert und die NLuc-Spiegel bei 2 dpi quantifiziert. TAK-981 steigerte tatsächlich die NLuc-Expression aus nicht integrierter HIV-1-DNA und erreichte ein Plateau bei ~75 nM, wo das Niveau der NLuc-Expression aus dem IN− NL-NLucΔEnv-Vektor in WT-Zellen dem in ΔSMC5-Zellen induzierten Niveau entsprach (Abb. 3a). . Im Gegensatz dazu hatte TAK-981 bei allen getesteten Dosen keinen Einfluss auf die Genexpression des IN− NL-NLucΔEnv-Reporters in ΔSMC5-Zellen, was argumentiert, dass die positive Wirkung von TAK-981 auf die Genexpression von nicht integrierter HIV-1-DNA in WT-CEM- SS-Zellen waren ausschließlich auf die Hemmung der SMC5/6-Funktion zurückzuführen.

a, Virale NLuc-Expression bei 2 dpi in WT- und ∆SMC5-CEM-SS-Zellen, die mit IN− NL-NLucΔEnv infiziert und ab Tag 0 mit den angegebenen Konzentrationen von TAK-981 behandelt wurden (****P < 0,0001, *P = 0,015). ; 2-Wege-ANOVA, Sidaks Test). b, Virale RNA-Spiegel für ungespleißte (Gag mRNA), einfach gespleißte (A1D1) und mehrfach gespleißte (A4D7) RNA in CEM-SS-Zellen, die mit IN+ oder IN– HIV-1 infiziert sind ±150 nM von TAK-981, gemessen bei 2 dpi . Die RNA-Spiegel wurden auf WT-HIV-1-Infektionen ohne TAK-981 normalisiert, das auf 1 gesetzt war, und die Statistiken wurden unter Verwendung eines zweiseitigen ungepaarten Welch-t-Tests berechnet (Gag: *P = 0,037, ***P = 0,004; A1D1: *P = 0,033, **P = 0,0012; A4D7: **P = 0,0059, **P = 0,0078). c, Virale NLuc-Expression bei 3 dpi in WT- und ∆SMC5-CEM-SS-Zellen, infiziert mit IN− NL-NLucΔEnv, mit 150 nM TAK-981 bei der angegebenen hpi hinzugefügt. Die NLuc-Expression wird relativ zu WT-CEM-SS-Zellen angegeben, die nicht mit TAK-981 behandelt wurden, das auf 1 gesetzt wurde. d–f, ChIP–qPCR zur Quantifizierung der Mengen an SUMO2/3 (d), H3Ac (e) und H3K9me3 ( f) auf dem HIV-1-LTR mit 3 dpi hinterlegt. TAK-981 (150 nM) wurde mit dem angegebenen hpi hinzugefügt. Die Daten von d–f wurden mithilfe der 2-Wege-ANOVA, Tukey-Test (****P < 0,0001, **P = 0,0012), analysiert. Die Daten in a–f sind der Mittelwert ± Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten.

Quelldaten

Um die Wirkung von TAK-981 auf die HIV-1-mRNA-Expression zu untersuchen, verwendeten wir qPCR, um die Menge an ungespleißten, einfach gespleißten und vollständig gespleißten HIV-1-Transkripten in WT-CEM-SS-T-Zellen zu quantifizieren, die mit WT- oder IN− HIV-1 infiziert waren in Gegenwart oder Abwesenheit von 150 nM TAK-981 (Abb. 3b). TAK-981 erhöhte die Expression viraler RNA-Spezies durch IN+ HIV-1 geringfügig, aber signifikant und steigerte die Expression aller drei Klassen viraler RNA durch IN− HIV-1 stark.

Um festzustellen, ob der Zeitpunkt der Zugabe von TAK-981 die virale Genexpression aus nicht integrierter HIV-1-DNA unterschiedlich beeinflussen würde, infizierten wir WT- oder ΔSMC5-CEM-SS-Zellen mit IN− NL-NLuc ΔEnv und fügten dann TAK-981 zu verschiedenen Zeitpunkten hinzu von 0 bis 48 PSi (Abb. 3c). Bei 72 hpi wurden die Zellen lysiert und die NLuc-Aktivität bestimmt. Die Zugabe von TAK-981 bei 0 hpi rettete die NLuc-Expression des IN− NL-NLucΔEnv-Reportervirus auf das Niveau, das im ΔSMC5-Subklon beobachtet wurde, und dies blieb bis 24 hpi der Fall. Allerdings war die Rettung der NLuc-Expression durch TAK-981 um 36 hpi schwächer und bei 48 hpi nicht nachweisbar. Um herauszufinden, ob die Zugabe von TAK-981 tatsächlich die SUMOylierung nicht integrierter chromatinisierter HIV-1-DNA hemmt, führten wir eine ChIP-PCR durch, um den SUMO-Spiegel auf dem viralen LTR in WT-CEM-SS-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von 150 nM zu bestimmen TAK-981 und im ΔSMC5-Klon bei 3 dpi mit IN− NL-NLucΔEnv. Die Zugabe von TAK-981 führte zum Verlust von SUMO aus nicht integrierter HIV-1-DNA, unabhängig davon, ob das Medikament früh oder spät nach der Infektion hinzugefügt wurde (Abb. 3d). Auch wenn TAK-981 die Genexpression nicht integrierter HIV-1-DNA nicht retten kann, wenn es mit 36 ​​hpi oder später hinzugefügt wird (Abb. 3c), bleibt es wirksam bei der Verhinderung der Aufrechterhaltung der dynamischen SUMO-Modifikation auf viraler DNA (Abb. 3d). Diese Daten legen nahe, dass die SUMOylierung durch SMC5/6 die epigenetische Stummschaltung nicht integrierter HIV-1-DNA auslöst, aber nicht erforderlich ist, um den stillgelegten Zustand aufrechtzuerhalten. Diese Hypothese wurde durch die ChIP-qPCR-Analyse der epigenetischen Modifikationen, die auf nicht integrierter viraler DNA in Gegenwart und Abwesenheit von TAK-981 vorhanden sind, weiter gestützt (Abb. 3e, f). Die Zugabe von 150 nM TAK-981 bei 16 hpi oder 24 hpi rettete die Zugabe der aktivierenden epigenetischen H3Ac-Modifikation zur nicht integrierten chromatinisierten HIV-1-DNA und blockierte die Zugabe des repressiven H3K9me3-Markers. Im Gegensatz dazu war TAK-981 um 36 hpi unwirksam bei der Umkehrung der epigenetischen Stummschaltung nicht integrierter HIV-1-DNA. Somit kann TAK-981 die epigenetische Unterdrückung von IN− HIV-1 verhindern, wenn es früh nach der Infektion angewendet wird, ist jedoch nicht in der Lage, bereits vorhandene, epigenetisch zum Schweigen gebrachte IN− HIV-1-Proviren zu retten, und fungiert daher nicht als Latenzumkehrmittel (LRA). ).

Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass eine Infektion mit IN+ HIV-1 Proviren erzeugen könnte, die vor der Integration epigenetisch zum Schweigen gebracht wurden und dann nach der Integration zum Schweigen gebracht wurden, wodurch latent infizierte T-Zellen entstehen27. Wenn das stimmt, sollte die Hemmung der Stummschaltung nicht integrierter HIV-1-DNA durch SMC5/6 auch die Bildung latent infizierter T-Zellen hemmen. Um diese Hypothese zu testen, fragten wir, ob ein Verlust der SMC5/6-Expression oder eine Behandlung mit TAK-981 bei 0 dpi die Etablierung latenter HIV-1-Infektionen in CEM-SS-T-Zellen hemmen würde. Der verwendete Assay28 beinhaltet die Infektion von WT- oder ΔSMC5 CEM-SS-Zellen mit dem IN+ NL-GFPΔEnv-Indikatorvirus in Gegenwart oder Abwesenheit von TAK-981 bei einer MOI von ~0,1. Bei 3 dpi wurden die Zellen FACS unterzogen und GFP-negative Zellen isoliert, die entweder nicht infizierte oder latent HIV-1-infizierte Zellen darstellten. Die FACS-Profile zeigten erneut einen höheren Anteil an GFP+-Zellen im WT-CEM-SS, der mit TAK-981 bei 0 dpi behandelt wurde, und im ΔSMC5-CEM-SS unabhängig von der TAK-981-Behandlung (Extended Data Abb. 6a), was vermutlich wiederum darauf zurückzuführen ist Transkription nicht integrierter IN+ HIV-1-Proviren. Die isolierten GFP-negativen Zellen wurden weitere 6 Tage lang kultiviert und dann mit dem Verdünnungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) oder mit TAK-981, Phorbolmyristatacetat (PMA) oder Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α) behandelt. Sowohl PMA als auch TNF-α sind wirksame Aktivatoren der NF-kB-Aktivität und wirksame LRAs28,29. Einen Tag später wurden die Zellen bei 10 dpi erneut durch FACS analysiert (ein repräsentatives Experiment ist in Abb. 4a dargestellt und eine Zusammenstellung von drei unabhängigen biologischen Replikaten ist in Abb. 4b dargestellt). Wichtig ist, dass die gesamte nicht integrierte HIV-1-DNA aus infizierten CEM-SS-Zellen um 7 dpi verloren ging (Extended Data Abb. 6b), sodass jede bei 10 dpi beobachtete GFP-Expression von integrierten Proviren stammen muss.

WT- oder ΔSMC5-CEM-SS-Zellen wurden mit IN+ NL-GFPΔEnv ±TAK-981 infiziert. Bei 3 dpi wurden GFP−-Zellen durch FACS isoliert (siehe Extended Data Abb. 6a für die relevanten FACS-Profile) und die Zellen dann für weitere 6 Tage kultiviert, um den Verlust der gesamten nicht integrierten HIV-1-DNA zu ermöglichen (Extended Data Abb. 6b) bevor es entweder mit dem Verdünnungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO), TAK-981 oder den LRAs PMA oder TNF-α behandelt wird. Einen Tag später wurde die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) bei 10 dpi durch FACS analysiert. a, Repräsentative FACS-Profile. b, Eine Zusammenfassung der Daten in a, die den Mittelwert ± Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten zeigt (****P < 0,0001, 2-Wege-ANOVA, Tukey-Test). c: Die gesamte HIV-1-DNA wurde in den angegebenen Zellen bei 9 dpi vor der Arzneimittelzugabe quantifiziert. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert ± Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten (****P < 0,0001, 1-Wege-ANOVA, Dunnett-Test).

Quelldaten

In WT-CEM-SS-Zellen induzierten PMA und TNF-α beide die GFP-Expression in etwa 5 % der sortierten GFP-negativen Zellen, während der Anteil an GFP+-Zellen in der nicht induzierten Kultur etwa 0,3 % betrug (Abb. 4a, b). ein Unterschied, der hochsignifikant ist (P < 0,001). Im Gegensatz dazu konnte eine PMA- oder TNF-α-Behandlung bei 9 dpi in WT-CEM-SS-Zellen, die bei 0 dpi mit TAK-981 behandelt wurden, oder im ΔSMC5-CEM-SS-Klon weder in Abwesenheit noch in Gegenwart von TAK eine GFP-Expression über dem Hintergrund induzieren -981-Behandlung bei 0 dpi (Abb. 4a, b), obwohl die anfängliche Infektion dieser Zellen, gemessen durch die GFP-Expression, tatsächlich höher war als bei WT-CEM-SS-Zellen (Erweiterte Daten, Abb. 6a).

Wenn der Verlust der Funktion des SMC5/6-Komplexes tatsächlich die Etablierung latenter HIV-1-Infektionen hemmt, sollten die FACS-sortierten WT-GFP−-Zellen (Extended Data Abb. 6) mehr latente provirale HIV-1-DNA enthalten als die GFP−-Zellen Zum Zeitpunkt der Infektion fehlte die SMC5/6-Funktion. Tatsächlich zeigte die bei 9 dpi vor der Medikamentenzugabe durchgeführte qPCR-Analyse, dass die isolierten WT-GFP−-Zellen tatsächlich deutlich (P < 0,001) mehr HIV-1-DNA enthielten als GFP− ΔSMC5-Zellen oder WT-Zellen, die zu diesem Zeitpunkt mit TAK-981 behandelt wurden der Infektion (Abb. 4c).

Wenn die epigenetische Stummschaltung nicht integrierter HIV-1-DNA zur Entstehung latenter Infektionen führen kann, könnte eine Verzögerung der Integration die Zahl latenter Infektionen erhöhen. Um diese Idee zu testen, infizierten wir WT-CEM-SS-Zellen mit der IN+-Form des NL-GFPΔEnv-Indikatorvirus in Gegenwart oder Abwesenheit des Integrase-Inhibitors Raltegravir. Das Medikament wurde bei 2 dpi ausgewaschen und GFP−-Zellen durch FACS bei 5 dpi isoliert. Die Zellen wurden dann mit Verdünnungsmittel, PMA oder TNF-α bei 11 dpi behandelt und mittels FACS bei 12 dpi analysiert. Die Behandlung mit Raltegravir von 0 auf 2 dpi erhöhte tatsächlich den Prozentsatz der Zellen, die GFP nach der Behandlung mit PMA oder TNF-α exprimierten, obwohl die Anzahl der GFP+, d. h. produktiven Infektionen, die bei 5 dpi nachgewiesen wurden, ähnlich war (Extended Data Abb. 7). Somit erhöht eine deutliche Verlängerung der Zeit zwischen proviraler DNA-Synthese und Integration (P < 0,001) die Anzahl latent integrierter Proviren, die dann durch eine LRA aktiviert werden können. Diese Daten zeigen, dass eine HIV-1-Latenz tatsächlich vor der proviralen Integration festgestellt werden kann.

Um zu untersuchen, ob SMC5/6 auch zur Etablierung einer Viruslatenz in Primärzellen beiträgt, haben wir zunächst bestätigt, dass TAK-981 auch die Genexpression von nicht integrierter HIV-1-DNA in infizierten primären CD4+-T-Zellen retten kann (Abb. 5a). Als nächstes fragten wir, ob TAK-981 die Etablierung latenter HIV-1-Infektionen in primären CD4+-T-Zellen hemmen könnte, indem wir einen Test für die HIV-1-Latenz verwendeten, der ein zweifarbiges Reportervirus verwendet30,31. In diesen Viren wird GFP unter der Kontrolle des HIV-1-LTR exprimiert, der bei latenten Infektionen stummgeschaltet wird, während mCherry unter Verwendung des exogenen EF1-α-Promotors exprimiert wird, der gegen epigenetische Stummschaltung resistent ist. Die Infektion von T-Zellen mit einem zweifarbigen HIV-1-Reporter erzeugt Zellen, die GFP+ und mCherry+ sind, was produktive Infektionen darstellt, und Zellen, die GFP−, aber mCherry+ sind, was latente Infektionen darstellt. Wir fragten daher, ob die Zugabe von TAK-981 bei 0 dpi, aber nicht bei 6 dpi zu Zellen, die mit dem IN+-Zweifarben-Reportervirus infiziert sind, die Menge an GFP− mCherry+-Zellen bei 7 dpi beeinflussen würde, dem frühesten Zeitpunkt, an dem alle nicht integriert sind HIV-1-DNA wäre verloren gegangen (Extended Data Abb. 8a).

a: Aus Blut isolierte CD4+-T-Zellen wurden mit IN+ oder IN− NL-NLucΔEnv in Gegenwart von 150 nM TAK-981 in DMSO oder nur mit DMSO bei 0 hpi infiziert. Die Zellen wurden bei 48 hpi gesammelt, lysiert und die NLuc-Werte bestimmt. Mittelwert ± Standardabweichung von 3 biologischen Replikaten (**P = 0,0045, zweiseitiger ungepaarter t-Test). b: CD4+-T-Zellen wurden mit einem replikationsdefekten GFP/mCherry-Zweifarben-Reportervirus bei einer niedrigen MOI von ~0,05 in Gegenwart von DMSO oder 150 nM TAK-981, die bei der Infektion hinzugefügt wurden, oder mit 150 nM TAK-981 infiziert oder 80 nM PMA bei 6 dpi hinzugefügt. Die Anzahl der GFP- und mCherry-exprimierenden Zellen wurde dann mittels FACS bei 7 dpi bestimmt. c–e, Daten von 5 unabhängigen primären CD4+-T-Zellinfektionen, die wie in b durchgeführt wurden, zeigen den Prozentsatz von GFP+ mCherry+ (c), GFP− mCherry+ (d) oder GFP− mCherry− (e) Zellen bei 7 dpi in Gegenwart von und Fehlen von TAK-981, hinzugefügt bei 0 dpi. Einzelne Experimente mit denselben T-Zellproben ±TAK-981 sind durch Linien verbunden. f, Statistische Analyse der Verhältnisse aus den in c–e gezeigten Daten unter Verwendung eines zweiseitigen verhältnispaarigen t-Tests.

Quelldaten

Tatsächlich beobachteten wir eine konsistente Verringerung der Anzahl latent infizierter primärer GFP-mCherry+-T-Zellen, wenn TAK-981 mit 0 dpi hinzugefügt wurde (von 2,11 % auf 0,79 % in Abb. 5b), konnten jedoch keine signifikante Auswirkung darauf feststellen die Menge an GFP− mCherry+-Zellen, wenn TAK-981 mit 6 dpi hinzugefügt wurde, wie vorhergesagt (Abb. 5b, siehe auch Erweiterte Daten Abb. 8b). Wir sahen einen gleichzeitigen Anstieg des Prozentsatzes der GFP+ mCherry+ T-Zellen in der mit TAK-981 behandelten Kultur bei 0 dpi (von 2,62 % auf 4,43 %, in Abb. 5b), was produktive Infektionen darstellt. Auch hier hatte die Zugabe von TAK-981 bei 6 dpi keine Auswirkung (Abb. 5b, siehe auch Erweiterte Daten Abb. 8b).

Wie in Abb. 5c–e gezeigt, in der Daten aus fünf unabhängigen biologischen Replikaten unter Verwendung primärer CD4+-T-Zellen von fünf verschiedenen Blutspendern dargestellt sind, sahen wir einen konsistenten Anstieg der Anzahl von GFP+-mCherry+-T-Zellen (Abb. 5c) und eine konsistente Abnahme der Anzahl der GFP− mCherry+-Zellen (Abb. 5d) in jedem analysierten Experiment. Insgesamt erhöhte die Zugabe von TAK-981 bei 0 dpi die Anzahl der produktiv infizierten GFP+ mCherry+-Zellen um das 1,62 ± 0,024-fache (P < 0,0001) und verringerte die Anzahl der latent infizierten GFP− mCherry+-Zellen um das 0,55 ± 0,115-fache (P =). 0,007) (Abb. 5f). Der Anstieg der GFP+ mCherry+-Zellen war nicht nur auf die GFP− mCherry+-Population zurückzuführen, sondern auch auf die GFP− mCherry−-Population, die in der mit TAK-981 bei 0 dpi behandelten Kultur geringfügig, aber signifikant zurückging (Abb. 5e, f, Gesamtverhältnis). 0,98 ± 0,006, P = 0,047). Daher hemmt die Behandlung mit TAK-981 bei 0 dpi auch die Bildung von Zellen, in denen sowohl der LTR- als auch der EF1-α-Promotor epigenetisch stummgeschaltet sind.

Hier zeigen wir, dass der menschliche SMC5/6-Komplex die SUMOylierung von chromatinisierter, nicht integrierter HIV-1-DNA induziert, was zu deren epigenetischer Stummschaltung führt. Infolgedessen rettet der Verlust der SMC5/6-Expression oder die Hemmung der Chromatin-SUMOylierung durch den Inhibitor TAK-981 die Genexpression von nicht integrierter HIV-1-DNA und ermöglicht sogar die Etablierung einer sich ausbreitenden Infektion in kultivierten T-Zellen durch IN− HIV-1 ( Abb. 1). Überraschenderweise zeigen wir auch, dass der Verlust der SMC5/6-Expression oder die Behandlung mit TAK-981 die Etablierung einer HIV-1-Latenz sowohl in der CEM-SS-T-Zelllinie als auch in primären CD4+-T-Zellen deutlich hemmt (Abb. 4 und 5). ).

Obwohl antiretrovirale Therapien die Viruslast bei AIDS-Patienten unter die Nachweisgrenze senken können, können diese Medikamente HIV-1 nicht heilen. Dies ist auf das anhaltende Vorhandensein einer kleinen Anzahl latent infizierter T-Zellen zurückzuführen, die integrierte intakte HIV-1-Proviren enthalten, die transkriptionell inert sind, jedoch durch äußere Reize aktiviert werden können, um die Virusreplikation wieder anzukurbeln32. Zwar wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, um LRAs zu entwickeln, die latentes HIV-1 aktivieren und bei Vorhandensein antiretroviraler Therapien den Körper von infektiösen Viren befreien können, doch ist es diesen Bemühungen bisher nicht gelungen, sowohl wirksame als auch nicht wirksame LRAs zu identifizieren -giftig.

Das latente Reservoir wurde aktivierten T-Zellen zugeschrieben, die mit HIV-1 infiziert werden und gleichzeitig in ruhende Gedächtnis-T-Zellen umgewandelt werden32. Allerdings kann eine HIV-1-Latenz sowohl in CD4-T-Zelllinien als auch in aktivierten T-Zellen in vitro festgestellt werden28,31, und der größte Teil des latenten Reservoirs bei Patienten, die sich antiretroviralen Therapien unterziehen, wird durch klonale Expansion aufrechterhalten33,34,35,36, wobei viele davon latent vorhanden sind Zellen, die die Proliferationsmarker HLA-DR37,38, CD2539 und CD6940 exprimieren. Somit ist die Unterdrückung der HIV-1-Genexpression in der Latenzzeit nicht einfach das Ergebnis des Ruhezustands ruhender Gedächtnis-T-Zellen. Es wurde auch vorgeschlagen, dass die Latenz aus der Integration von HIV-1-Proviren in Regionen des Heterochromatins resultiert, was zu einer epigenetischen Stummschaltung führt41. Die Analyse einzelner latenter HIV-1-Integrationsstellen bei Patienten hat jedoch gezeigt, dass die meisten intakten HIV-1-Proviren voller Länge in aktiv transkribierte Gene integriert sind42,43,44,45,46. Insgesamt blieben die Mechanismen, die der Etablierung der HIV-1-Latenz zugrunde liegen, schwer fassbar und die zellulären Faktoren, die die Viruslatenz fördern, weitgehend undefiniert.

Unsere Daten legen nahe, dass der Schlüsselmechanismus, der der Auslösung der HIV-1-Latenz zugrunde liegt, die epigenetische Stummschaltung nicht integrierter Proviren durch SMC5/6 ist, die ihre bereits bestehenden inhibitorischen epigenetischen Modifikationen nach der Integration beibehalten. Diese Daten weisen darauf hin, dass der SMC5/6-Komplex direkt an der Förderung der HIV-1-Latenz beteiligt ist, und legen nahe, dass die Latenz nicht auf intrinsische Eigenschaften des eindringenden Retrovirus zurückzuführen ist, sondern eher auf eine unglückliche Nebenwirkung einer zellulären angeborenen Immunantwort zurückzuführen ist entwickelt, um invasive fremde DNA zum Schweigen zu bringen.

Menschliche 293T-Zellen (weiblich) wurden ursprünglich von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Hyclone) und einem Antibiotikum-Antimykotikum (Gibco), kultiviert ).

Menschliche CEM-SS-Zellen (weiblich) wurden aus dem NIH-AIDS-Reagenz gewonnen und in Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), ergänzt mit 10 % FBS und Antibiotika-Antimykotikum, kultiviert.

CEM-SS-Zellen, die das Cas9-Protein stabil exprimieren, wurden unter Verwendung eines modifizierten pLentiCrispr v2-Blast-Plasmids hergestellt, das ein Geschenk von Mohan Babu war (Addgene-Plasmid 83480). Der U6-Promotor, das sgRNA-Gerüst und der EF1-α-Promotor wurden durch Spaltung mit KpnI und AgeI aus pLentiCrispr v2-Blast herausgeschnitten und durch einen SFFV-Promotor ersetzt. Aus diesem Konstrukt wurden Lentiviren hergestellt, indem 5 × 106 293T-Zellen in einer 15-cm-Schale mit 15 µg des lentiviralen Vektors sowie 10 µg bzw. 5 µg der Verpackungsplasmide pCMVR8.74 und pMD2.G unter Verwendung von Polyethylenimin transfiziert wurden (PEI). Die Medien wurden 24 Stunden nach der Transfektion (HPT) gewechselt. Überstände, die lentivirale Partikel enthielten, wurden bei 72 PS gesammelt, durch einen 0,44-µm-Filter filtriert und durch einen 100.000 MWCO-Konzentrator (Amicon) geleitet. Nach der Konzentration wurden 5 × 106 CEM-SS-Zellen mit 2 ml des konzentrierten Überstands über Nacht bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Medien durch frisches RPMI-Medium ersetzt und die Zellen 48 Stunden lang inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Medien durch frisches RPMI-Medium ersetzt, das mit 20 µg ml-1 Blasticidin (Santa Cruz) ergänzt war, um die Selektion transduzierter Zellen zu ermöglichen. Anschließend wurden die Zellen einzeln geklont, indem eine begrenzte Verdünnung in Platten mit 96 Vertiefungen aliquotiert wurde, sodass in jeder Vertiefung eine Wahrscheinlichkeit von etwa 10 % bestand, dass sich eine Zelle darin befand. Diese geklonten Zellen wurden dann auf Cas9-Aktivität analysiert.

Menschliches Blut von gesunden Spendern wurde vom Gulf Coast Regional Blood Center gekauft. Alle Spender wurden negativ auf HIV-1 und HIV-2 getestet. Die Proben wurden vor dem Kauf anonymisiert. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus Vollblut durch Dichtegradientenzentrifugation über Histopaque (Sigma) isoliert und CD4+-Zellen mithilfe eines CD4+-Isolierungskits (Invitrogen) isoliert. Isolierte CD4+-Zellen wurden durch Inkubation mit Antikörpern gegen CD28/CD49d (BD Biosciences) und 5 µg ml-1 Phytohämagglutinin (PHA) in RPMI, ergänzt mit 10 % FBS und IL-2, wie zuvor beschrieben, aktiviert47. Die Zellenzahl wurde vor der Infektion mit HIV-1 eine Woche lang in Gegenwart von IL-2, CD28/CD49d-Antikörpern und PHA bei 105–106 Zellen pro ml gehalten.

Ein HIV-1-Nano-Luciferase-Reportervirus (NL-NLuc) wurde aus dem Elternvirus NL4-3 erzeugt, indem das virale nef-Gen in NL4-3 durch das NLuc-Indikatorgen ersetzt wurde48. NL-NLucΔEnv wurde aus NL-NLuc hergestellt, indem ein 943-bp-Segment des env-Gens entfernt wurde, das es replikationsinkompetent macht. In ähnlicher Weise wurde das GFP-Reportervirus (NL-GFPΔEnv) aus NL-NLucΔEnv erzeugt, indem GFP anstelle von nef eingesetzt wurde. Das NL-DC-Reportervirus exprimiert eGFP unter der Kontrolle des HIV-1-LTR und mCherry von einem internen EF1-α-Promotor und wurde durch Klonieren einer EF1-α:mCherry-Kassette in die XhoI-Stelle erzeugt, die sich 3′ von GFP in NL-DC befindet. GFPΔEnv. Alle diese Reporterviren verfügen über ein intaktes vpr-Gen.

Ein GFP-Reportervirus, IN− NL-GFPΔVpr, dem ein funktionelles Vpr-Protein fehlt, wurde aus dem parentalen IN− NL-GFP-Virus durch Einfügen einer TTAA-Duplikation bei 15 bp 3′ des Vif-Stoppcodons erzeugt. Dadurch werden ein Stoppcodon und eine Frameshift-Mutation früh im offenen Leserahmen von Vpr eingeführt, wodurch ein nicht funktionsfähiges verkürztes Vpr-Protein entsteht49. Diese Viren verfügen entweder über WT-Integrase (IN+) oder enthalten die D64V-Mutation (IN−), die die IN-Funktion blockiert.

Plasmide, die das replikationskompetente NL-NLuc-Provirus exprimieren, wurden unter Verwendung von PEI in 293T-Zellen transfiziert. Nicht ausbreitende NL-NLucΔEnv- und NL-GFPΔEnv-Proviren wurden mit dem pMD2.G-Plasmid, das das VSV-G-Protein kodiert, in 293T-Zellen cotransfiziert. Nach 24 Stunden wurden die verbrauchten Medien durch frische Medien ersetzt. Bei 72 PS wurden die überstehenden Medien durch einen 0,44-μm-Filter filtriert. WT- oder IN-HIV-1-haltige Überstandsmedien wurden durch die mittels ELISA gemessenen p24-Spiegel normalisiert, bevor sie zur Infektion von Zielzellen verwendet wurden. Das Verhältnis MOI:p24-normalisiertes Volumen wurde durch Infektion von 106 CEM-SS-Zellen mit IN+ NL-GFPΔEnv oder einer durch CEM-SS induzierbaren Tax-Zelllinie (die ein HTLV-1-Tax-Protein exprimiert, von dem bekannt ist, dass es die Genexpression von nicht integriertem HIV aktiviert) ermittelt -110) mit IN− NL-GFPΔEnv. Diese Zellen wurden mit unterschiedlichen Verdünnungen des Virus infiziert und dann mittels Durchflusszytometrie bei 2 dpi analysiert (Gating-Strategie, dargestellt in Extended Data Abb. 9). Die Anzahl der GFP+-Zellen bei jeder Verdünnung wurde dann unter Verwendung der Formel MOI = −ln (1− Anteil an GFP+-Zellen) in MOI umgerechnet, die dann mit dem p24-Gehalt im Virusstamm korreliert wurde. Somit konnte die Menge des verwendeten IN−-Virus (pro Million Zellen) für jedes MOI bestimmt werden.

Die humane CRISPR-Knockout-Bibliothek von Brunello (Addgene 73178)15 wurde zur Transformation elektrokompetenter Zellen (Endura) verwendet. Von der Bibliothek (in Wasser resuspendiert) wurden 500 ng verwendet, um insgesamt 4 × 25 μl Zellen in einer 1-mm-Küvette (10 μF, 600 Ω, 1,8 kV) zu transformieren, um beim Ausplattieren mehr als 108 Kolonien zu ergeben, um jede sgRNA sicherzustellen in der Bibliothek wurde im Durchschnitt etwa 1.000-fach abgedeckt. Diese Kolonien wurden gesammelt und die gepoolten Bibliotheksplasmide unter Verwendung von Maxiprep-Säulen (Zymo) extrahiert.

Lentivirale Bibliotheken wurden durch Transfektion von 293T-Zellen mit Bibliotheks-DNA und den Verpackungsplasmiden pCMVR8.74 und pMD2.G unter Verwendung von PEI erstellt. Die Medien wurden bei 24 PS gewechselt und der Überstand, der die Lentivirus-Bibliothek enthielt, wurde gesammelt und durch einen 0,44-µm-Filter bei 72 PS filtriert. Das Lentivirus wurde titriert und zur Transduktion von CEM-SS-Cas9-Zellen verwendet, die dann Puromycin (Gemini)-Abtötungskurven bei 2 dpt unterzogen wurden, um die Menge an Lentivirus zu bestimmen, die einer MOI von 0,3 entsprach. Diese Menge wurde dann verwendet, um 108 CEM-SS Cas9-Zellen bei 0,3 MOI zu transduzieren, und die Zellen wurden eine Woche lang in 1 µg ml-1 Puromycin bei 2 dpt selektiert.

Die gepoolten Knockout-Zellen wurden dann 2 Tage lang mit einem IN− HIV-1 NL-GFP-Reportervirus infiziert, das eine inaktivierende D64V-Aminosäuresubstitution im Integrase-Gen aufweist. Diese infizierten Zellen wurden dann durch ein BSL-3 enthaltendes FACS Aria II (BD Biosciences) laufen gelassen, um die GFP+-Zellpopulation zu sammeln, aus der genomische DNA extrahiert wurde. Gereinigte gDNA wurde mit dem Restriktionsenzym DpnI inkubiert, um jegliche restliche Plasmidkontamination zu entfernen.

Die sgRNA aus dieser DNA wurde durch PCR unter Verwendung flankierender Primer (FP: 5′-TGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGA -3′ RP: 5′-GGCTCGAGGGGGCCCGGGTGCAAAGATGGATA -3′) amplifiziert und dann über die NdeI- und XmaI-Restriktionsstellen zurück in das Elternplasmid pLentiGuide Puro kloniert. Nachfolgende Runden der Transformation, Lentivirus-Produktion, Transduktion und Infektion wurden wie beschrieben für insgesamt drei Runden durchgeführt. In der letzten Runde wurde die DNA mit den indizierten Illumina-Sequenzierungsprimern amplifiziert, in einer PCR-Reinigungsspinsäule (Zymo) gereinigt und auf dem NovaSeq 6000 sequenziert.

Sequenzierungsdaten wurden mit MAGECK-VISPR50 analysiert, indem zunächst sgRNA-Lesezahlen durch Aufrufen von „mageck count“ generiert, die sgRNA-Anreicherung analysiert und Genränge mithilfe des Robust Rank Aggregation-Algorithmus für normalisierte Lesezahlen ermittelt wurden. Der „Mageck-Test“ wurde mit den Parametern „–remove-zero Both–remove-zero-threshold 0“ durchgeführt, wie zuvor vorgeschlagen51.

Einzelgen-Knockout-Zellen wurden durch Transduktion von CEM-SS-Cas9-Zellen mit Lentiviren erzeugt, die aus einem pLentiGuide-Puro-Plasmid (Addgene 52963)52 hergestellt wurden, das die interessierende sgRNA exprimierte. Transduzierte Zellen wurden 1 Woche lang bei 2 dpt mit 1 µg ml-1 Puromycin selektiert. Infektionsexperimente an polyklonalen Knockout-Zellen wurden durchgeführt, indem Zellen in diesem Stadium infiziert wurden.

Klonale Zellen wurden isoliert, indem Puromycin-resistente Zellen mit limitierender Verdünnung in eine 96-Well-Platte aliquotiert und anschließend isoliert und expandiert wurden. Anschließend wurden Knockout-Zellen durch klonale Sequenzierung der genetischen Läsionen und Western Blot identifiziert und validiert.

Die Zellen wurden gesammelt und in Laemmli-Puffer lysiert, mit Ultraschall behandelt und 15 Minuten lang bei 95 °C denaturiert. Die Lysate wurden einer Elektrophorese auf 4–20 % SDS-Polyacrylamidgelen (Bio-Rad) unterzogen, auf Nitrozellulosemembranen übertragen und dann in 5 % Milch in PBS + 0,1 % Tween blockiert. Die Membranen wurden in primären und sekundären Antikörpern, verdünnt in 5 % Milch in PBS + 0,1 % Tween, jeweils 2 Stunden lang inkubiert und dann in PBS + 0,1 % Tween gewaschen. Die Membranen wurden mit einem verstärkten Chemilumineszenzsubstrat auf Luminolbasis inkubiert und die Signale wurden mit GeneSnap (Syngene) sichtbar gemacht. Die Membranen wurden mit spezifischen Antikörpern immungeblottet, um SMC5 (Research Resource Identifier RRID:AB_2900565), SMC6 (RRID:AB_2747157), NSMCE2 (RRID:AB_10637854), NSMCE4A (RRID:AB_11169701), SLF1 (RRID:AB_10816722), SLF2 ( RRID:AB_11129755), FLAG (RRID:AB_259529) oder Actin (RRID:AB_2687938). Primärantikörper wurden in einer Verdünnung von 1:1.000 verwendet, mit Ausnahme des Aktin-Antikörpers, der in einer Verdünnung von 1:5.000 verwendet wurde. Sekundäre HRP-konjugierte Anti-Maus- (RRID:AB258431) oder Anti-Kaninchen-Antikörper (RRID:AB_258284) wurden in einer Verdünnung von 1:5.000 verwendet.

Die Zellen wurden gesammelt, in PBS gewaschen und 10 Minuten lang in 1 % Paraformaldehyd in PBS fixiert, bevor sie in 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS resuspendiert und durch ein Zellsieb laufen gelassen wurden. Die Zellen wurden durch ein Fortessa X20-Durchflusszytometer (BD Biosciences) laufen gelassen und die Daten mit FlowJo v10.6.2 analysiert.

Die Zellen wurden gesammelt, dreimal in PBS gewaschen, in passivem Lysepuffer (Promega) lysiert und mit dem Nano-Glo-Luciferase-Assay auf einem Lumat LB9507-Luminometer (Bertold Technologies) auf NLuc-Aktivität untersucht.

Zellen (107) aus der parentalen Cas9-Zelllinie oder den ΔSMC5- und ΔSLF2-Zelllinien wurden entweder mit dem WT- oder dem IN−NL-NLuc-Virus in insgesamt 20 ml RPMI infiziert. Virusbestände wurden mit 5 U ml−1 DNase I vorbehandelt, um restliche Plasmid-DNA zu entfernen, und alle IN−-Infektionen wurden in Gegenwart von 20 µM Raltegravir durchgeführt, um revertierte Mutationen zu verhindern. Die Zellen wurden, soweit möglich, an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 10, 12, 14 und 16 dpi gezählt und die Medien wurden regelmäßig erneuert, um die Zellzahl unter 106 Zellen pro ml zu halten. Lebende Zellen (106) wurden zu jedem Zeitpunkt gesammelt (wo möglich) und gleichmäßig aufgeteilt, um NLuc zu testen und DNA und RNA zu extrahieren.

Zur DNA-Analyse wurden die Zellen pelletiert und dreimal in eiskaltem PBS gewaschen. Anschließend wurde die DNA mithilfe von DNA-Miniprep-Plus-Säulen (Zymo) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert und anschließend mit DpnI (NEB) inkubiert, um jegliche restliche Plasmidkontamination zu entfernen.

Für die RNA-Analyse wurden die Zellen in TRIzol (Thermo Fisher) lysiert, um die RNA zu sammeln, und mit DNAse I behandelt, um restliche DNA-Kontaminationen zu entfernen. Die RNA wurde dann mit dem High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) in komplementäre DNA umgewandelt.

Die Quantifizierung der gesamten HIV-1-DNA und -RNA wurde auf einem QuantStudio 6 Pro Echtzeit-qPCR-Gerät (Thermo Fisher) unter Verwendung einer benutzerdefinierten Gesamt-HIV-1-TaqMan-Sonde durchgeführt, die die U5-gag-Region auf HIV-1 verstärkt.

Für die verschachtelte Alu-LTR-Echtzeit-qPCR wurde die DNA mithilfe eines verschachtelten PCR-Ansatzes amplifiziert18. Kurz gesagt, eine anfängliche nicht sättigende PCR unter Verwendung der Primer ALU1 (5′-TCCCAGCTACTGGGGAGGCTGAGG-3′), ALU2 (5′-GCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACA-3′) und L-HIV (5′-ATGCCACGTAAGCGAAACTTAAGCCTCAATAAAGCTTGC-3′) wurde unter Verwendung von isolierter DNA durchgeführt HIV-1-infizierte Zellen. Nachdem die PCR-Produkte mit einem PCR-Kleen-Kit (Bio-Rad) gereinigt wurden, wurde eine verschachtelte qPCR mit den Primern AA55M (5′- GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA-3′) und L (5′-ATGCCACGTAAGCGAAAC-3′) und dem SYBR Green Master Mix durchgeführt (Thermo Fisher).

Die Mengen an nicht integrierter zirkulärer 2LTR-HIV-1-DNA wurden durch qPCR unter Verwendung von TaqMan-Primern/Sonden quantifiziert, die über die U5-U3-Verbindung amplifizieren, die nur in 2LTR-Kreisen vorhanden ist (FP: 5′- AACTAGGGAACCCACTGCTTAAG -3′, RP: 5′- TCCACAGATCAAGGATATCTTGTC - 3′, Sonde: 5′- FAM- ACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTT -TAMRA-3′)53.

Die relative Quantifizierung unter Verwendung der ΔΔCT-Methode mit β-Actin als interner Kontrolle wurde dann entweder unter Verwendung einer genomischen β-Actin (DNA) oder einer gespleißten β-Actin (RNA)-Sonde durchgeführt. Anschließend wurde eine relative Quantifizierung unter Verwendung der ΔΔCT-Methode54 mit β-Actin als interner Kontrolle durchgeführt.

Die angegebenen Zellen wurden mit 106 Zellen pro ml in RPMI kultiviert und mit IN-NL-GFP infiziert. Virusbestände wurden mit 5 U ml−1 DNase I vorinkubiert, um Plasmidkontaminationen vor der Infektion zu entfernen.

Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion gesammelt, zweimal mit PBS gespült und 15 Minuten lang bei 25 °C mit 1 % Formaldehyd vernetzt, bevor sie 5 Minuten lang in 0,125 M Glycin gequencht wurden. Die gespülten Zellen wurden dann in ChIP-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 % Natriumdodecylsulfat, 10 mM EDTA) lysiert und auf Eis mit einem Fisher Sonic Dismembrator 60 (Ausgang 4,5, 20-s-Puls 6-mal wiederholt) beschallt Eis mit 40 s zwischen jeder Beschallung). Der Überstand, der beschalltes Chromatin enthielt, wurde durch Zugabe magnetischer Protein-G-Dynabeads (Thermo Fisher), die mit denaturierter Lachssperma-DNA (Invitrogen) vorbehandelt worden waren, vorgeklärt. Die Magnetkügelchen wurden entfernt und das beschallte Chromatin über Nacht bei 4 °C unter Verwendung von 2,5 µg des angegebenen Antikörpers in ChIP-Verdünnungspuffer (16,7 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 % Triton X-100, 0,01 % SDS, 150 mM) inkubiert NaCl, 1,2 mM EDTA). Das beschallte Chromatin (5 %) wurde ohne weitere Behandlung bis zum Rückvernetzungsschritt als Input-DNA gelagert.

Anschließend wurden Protein-G-Dynabeads zur Chromatin-Antikörper-Mischung gegeben, 2 Stunden bei 4 °C inkubiert und dann dreimal mit ChIP-LiCl-Puffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 % NP-40, 250 mM LiCl, 1) gewaschen mM EDTA, 1 % Na-Desoxycholat) und zweimal mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 mM EDTA). Protein-DNA-Komplexe wurden mit einem Elutionspuffer (0,1 M NaHCO3, 1 % SDS) von den Perlen eluiert, durch Inkubation bei 65 °C für 16 Stunden und bei 95 °C für 15 Minuten entvernetzt und dann durch Zugabe von 50 μg verdaut Proteinase K und Inkubation bei 50 °C für 3 Stunden. Die DNA wurde mit einem DNA-Miniprep-Plus-Kit (Zymo) extrahiert, mit DpnI (NEB) verdaut, um jegliche Plasmidkontamination zu entfernen, und dann für die qPCR-Analyse unter Verwendung von Primern verwendet, die U5-R auf dem HIV-1-Promotor amplifizieren (FP: 5′-CTCTCTGGTTAGACCAGATC). -3′, RP: 5′-GCTAGAGATTTTCCACACTG-3′). ChIP-Daten werden als Prozentsatz der eingegebenen DNA ausgedrückt.

Ein lentiviraler Vektor, der ein FLAG-markiertes NSMCE2-Protein exprimiert, das gegen das Schneiden durch die in den CEM-SS ΔNSMCE2-Knockout-Zellen exprimierte sgRNA resistent ist, wurde durch Mutation der NSMCE2-Sequenz aus einem Expressionsplasmid (OHu31586, GenScript) mittels Overlap-Extension-PCR zur Einführung eines Synonyms erstellt TC- und CT-Mutationen in der sgRNA-Zielsequenz (GTATCAACTCTGGTATGGAC zu GcATtAACTCTGGTATGGAC). Dieses mutierte FLAG-NSMCE2-PCR-Produkt wurde dann unter Verwendung von NheI- und XhoI-Restriktionsstellen in den lentiviralen pLCE-Vektor kloniert.

In ähnlicher Weise wurde die NSMCE2ΔSUMO-Mutante mithilfe einer Overlap-Extension-PCR erstellt, um die C185S- und H187Q-Aminosäuresubstitutionen in die RING-Domäne einzuführen, die für die E3-SUMO-Ligasefunktion erforderlich sind25.

Lentiviren wurden aus pLCE (Kontrolle), pLCE FLAG-NSMCE2 und pLCE FLAG-NSMCE2ΔSUMO erstellt, die dann zur Transduktion von CEM-SS- oder CEM-SS ΔNSMCE2-Zellen verwendet wurden. Diese Zellen wurden mit IN+/IN− NL-NLuc oder IN− NL-GFP bei 0,3 MOI infiziert und die Zellen wurden bei 2 dpi für die jeweiligen NLuc-Assays (NL-NLuc) oder für Durchflusszytometrie und ChIP-qPCR (NL) gesammelt -GFP). Die Expression dieser NSMCE2-Konstrukte wurde durch Western Blot validiert.

TAK-981 (MedChemExpress) ist ein globaler Inhibitor der SUMOylierung26 und wurde in DMSO zu einer 5 mM Stammlösung rekonstituiert. TAK-981 wurde zu CEM-SS Cas9- und ΔSMC5-Zellen hinzugefügt, die mit NL-NLuc in Konzentrationen von 0, 5, 15, 30, 75, 150, 500 und 1.000 nM infiziert waren, und die Zellen wurden nach 2 dpi für einen NLuc-Assay gesammelt.

Um die Auswirkungen von TAK-981 auf die virale RNA-Expression in infizierten Zellen zu untersuchen, wurden CEM-SS-Zellen mit IN+/IN− NL-NLuc in Gegenwart oder Abwesenheit von 150 nM TAK-981 infiziert. Die RNA wurde bei 2 dpi mit TRIzol (Thermo Fisher) extrahiert und 2 Stunden lang mit DNAse I behandelt. Anschließend wurde cDNA mit dem High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) hergestellt. Die Mengen an ungespleißter HIV-1-RNA-gag oder der gespleißten viralen RNA von Donor 1-Akzeptor 1 (A1D1) und gespleißtem Donor 7-Akzeptor 4 (A4D7) wurden durch qPCR unter Verwendung der Primer für gag (FP: 5′-GCGAGAGCGTCGGTATTAAGCG-3′) quantifiziert. , RP: 5′-AATCGTTCTAGCTCCCTGCTTGC-3′), A1D1 (FP: 5′-GATCTCTCGACGCAGGACTC-3′, RP: 5′-TGGTCCTTTCCAAACTGGAT-3′) und A4D7 (FP: 5′-CAAGCTTCTCTATCAAAGCAACC -3′, RP: 5 '- AATCGAATGGATCTGTCTCTGTC -3′)55.

Um die Kinetik der Hemmung der SUMOylierung auf die virale Genexpression und epigenetische Modifikationen in infizierten Zellen zu verstehen, wurden 150 nM TAK-981 zu CEM-SS Cas9- und ΔSMC5-Zellen zum Zeitpunkt der Infektion oder bei 16, 19, 21, 24, 36 hinzugefügt und 48 PSi. Die Zellen wurden mit NL-NLuc Δenv infiziert und bei 72 hpi für entweder NLuc-Assays oder ChIP-qPCR unter Verwendung von Anti-SUMO2/3-, H3Ac- oder H3K9me3-Antikörpern und Quantifizierung des HIV-1-Promotors mithilfe von Primern gesammelt, die die U5-R-Region (FP) amplifizieren : 5'-CTCTCTGGTTAGACCAGATC-3′, RP: 5'-GCTAGAGATTTTCCACACTG-3′). ChIP-Daten werden als Prozentsatz der eingegebenen DNA ausgedrückt.

WT- oder ΔSMC5-CEM-SS-Zellen wurden mit dem IN+ NL-GFPΔEnv-Virus bei einer MOI von ~0,1 in Gegenwart oder Abwesenheit von 150 nM TAK-981 infiziert. Den Zellen wurde Nevirapin bei 2 dpi zugesetzt, um späte Infektionsereignisse zu verhindern, und bei 3 dpi wurden die Zellen gewaschen und in 2 % BSA in PBS resuspendiert, um sie auf einem BSL-3 enthaltenden FACS Aria II (BD Biosciences) zu sortieren, um GFP zu isolieren − Zellen. Diese Zellen konnten sich 6 Tage lang (9 dpi) im Wachstumsmedium erholen, bevor sie mit DMSO, 150 nM TAK-981, 80 nM PMA oder 1 ng ml-1 TNF-α behandelt wurden. Die Zellen wurden am nächsten Tag gesammelt (10 dpi), um die GFP-Expression mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.

WT- oder ΔSMC5-CEM-SS-Zellen wurden mit dem IN+ NL-GFPΔEnv-Virus in Gegenwart oder Abwesenheit von 500 nM Raltegravir infiziert. Bei 2 dpi wurden alle Zellen dreimal mit PBS gewaschen, erneut in RPMI mit Nevirapin ausplattiert und weitere 3 Tage kultiviert. Bei 5 dpi wurden die GFP−-Zellen sortiert, man ließ sie sich 6 Tage lang in Wachstumsmedien erholen, behandelte sie mit DMSO, PMA oder TNF-α (11 dpi) und analysierte sie am nächsten Tag für die Durchflusszytometrie (12 dpi).

Sowohl CEM-SS-Kontroll- als auch ΔSMC5-Zellen wurden mit einer normalisierten p24-Menge infiziert, die zuvor titriert wurde, um 10 % GFP+-Zellen in CEM-SS-Zellen +Ral (~0,45 MOI) und −Ral (0,1 MOI) bei 5 dpi zu ergeben.

Aus PBMCs isolierte aktivierte primäre T-Zellen wurden bei einer niedrigen MOI von ~0,05 mit einem IN+ NL-DC-Reportervirus infiziert, das eGFP aus dem HIV-1-LTR und mCherry aus einem internen EF1-α-Promotor exprimiert. Infektionen wurden in Gegenwart und Abwesenheit von 150 nM TAK-981 durchgeführt, die bei der Infektion hinzugefügt wurden, oder mit 80 nM PMA, von dem bekannt ist, dass es die epigenetische Stummschaltung von HIV-1 in latenten Zellen umkehrt56, oder mit 150 nM TAK-981, das 24 Stunden vor der Entnahme zugesetzt wurde. Die Zellen wurden für die Durchflusszytometrie bei 7 dpi in 2 % BSA in PBS gesammelt, um die eGFP- und mCherry-Fluoreszenz zu messen. Die CD4+-T-Zellpopulation wurde durch Gating-on-Forward- und Side-Scatter-Analysen von toten Zellen und Zelltrümmern getrennt. Die hohe Anreicherung durch das CD4 Positive Isolation Kit (Invitrogen) ermöglichte es uns auch, die angereicherte CD4+-T-Zellpopulation zu identifizieren und ein Gating durchzuführen, um die wenigen möglicherweise vorhandenen CD4+-Monozyten auszuschließen. Anschließend wurden die Durchflusszytometriedaten mit FlowJo v10.6.2 analysiert.

Aus diesen Zellen wurde auch DNA mit 2, 3, 5 und 7 dpi extrahiert, mit DpnI inkubiert, um restliche HIV-1-Plasmidverunreinigungen zu entfernen, und dann die Mengen an nicht integrierter 2LTR HIV-1-zirkulärer DNA durch qPCR quantifiziert, wie in einem vorherigen Abschnitt beschrieben.

Probengröße und P-Werte werden im Text oder in den Abbildungslegenden angegeben. Fehlerbalken in den Experimenten stellen Standardabweichungen vom Mittelwert unabhängiger Experimente dar. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism durchgeführt oder mit den angegebenen Rechentools erstellt, die bei der Analyse des CRISPR-Knockout-Screens verwendet wurden. Informationen zu statistischen Methoden finden Sie in den Legenden der Abbildungen.

Alle in dieser Studie generierten einzigartigen Materialien werden auf begründete Anfrage dem leitenden Ansprechpartner zur Verfügung gestellt und werden auch über das NIH AIDS Reagent Program zur Verfügung gestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Die in dieser Studie generierten Sequenzierungsdaten sind im NCBI Sequence Read Archive mit der Datensatzkennung SRR18245559 (CRISPR Knockout Screen) verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Diese Forschung wurde durch den NIH-Zuschuss R21-AI157616 an BRC unterstützt und erhielt Infrastrukturunterstützung vom Duke CFAR (P30-AI064518).

Abteilung für Molekulargenetik und Mikrobiologie, Duke University Medical Center, Durham, NC, USA

Ishak D. Irwan, Hal P. Bogerd und Bryan R. Cullen

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BRC hat das Projekt konzipiert. IDI und BRC haben die Experimente entworfen. IDI und HPB führten die Experimente durch. IDI und BRC analysierten die Daten. IDI und BRC haben das Manuskript mit Unterstützung von HPB verfasst

Korrespondenz mit Bryan R. Cullen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(ab) Polyklonale Populationen von CEM-SS Cas9-Zellen, transduziert mit 2 verschiedenen sgRNAs, die für die angegebenen Gene spezifisch sind, und dann mit (A) IN-NL-GFPΔEnv und (B) IN-NL-NLucΔEnv-Reportervirus infiziert. %GFP + Zellen in A wurden durch Durchflusszytometrie bei 2 dpi bestimmt. Die NLuc-Expression in B wurde auf CEM-SS Cas9-Zellen normalisiert, die mit einer durcheinandergemischten sgRNA transduziert wurden, die auf 1,0 eingestellt war. Die in Tafel B gezeigten Daten stellen den Durchschnitt von drei biologischen Replikaten dar, wobei die SD angegeben ist.

Quelldaten

Jede der angegebenen klonalen Knockout-Zelllinien wurde lysiert und anschließend einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung kommerzieller Antikörper unterzogen, die für die angegebene SMC5/6-Komplexkomponente spezifisch sind. Als Ladungskontrolle wurde Actin verwendet. Die hier gezeigten repräsentativen Blots weisen auf mindestens drei biologische Replikate hin.

Quelldaten

(a) 7-Tage-Wachstumskurven für nicht infizierte CEM-SS-Cas9-Zellen oder die ∆SMC5- und ∆SLF2-CEM-SS-Klone, unter Berücksichtigung aller lebenden Zellen in Kultur. (b, c) Die angegebenen Zelllinien wurden mit IN + / IN- HIV-1 infiziert und die Mengen an (B) nicht integrierter 2LTR-DNA und (c) integrierter HIV-1-DNA wurden durch qPCR bzw. Alu-qPCR quantifiziert. Die DNA-Spiegel wurden auf IN + HIV-1-infizierte CEM-SS Cas9-Zellen bei 1 dpi normalisiert, was auf 1 eingestellt war. Die gezeigten Daten stellen den Durchschnitt von drei biologischen Replikaten dar, wobei SD angegeben ist. (d) Die angegebenen klonalen Knockout-CEM-SS-Zelllinien wurden mit IN + oder IN- NL-NLucΔEnv infiziert und die virale NLuc-Expression wurde dann bei 2 dpi getestet. Die NLuc-Werte werden im Verhältnis zu WT-CEM-SS-Cas9-Zellen angegeben, die mit IN-NL-NLucΔEnv (Kontrolle) infiziert waren und auf 1,0 eingestellt waren. Durchschnitt aus drei biologischen Replikaten mit Angabe der SD. Die Daten wurden mithilfe der einfaktoriellen ANOVA, dem Fisher-LSD-Test, analysiert (p-Werte im Diagramm angegeben, ****p < 0,0001).

Quelldaten

Die angegebenen Zelllinien wurden mit IN + und IN- NL-GFP infiziert und einer ChIP-qPCR bei 2 dpi unterzogen, um die Mengen der aktivierenden Histonmodifikationen H3Ac und H3K4me3 und der repressiven Modifikationen H3K9me3 und H3K27me3 zu quantifizieren, die an virale LTR-DNA gebunden sind. (a) H3Ac und (b) H3K4me3 (c) H3K9me3, (d) Gesamthiston H3 und (e) H3K27me3. Durchschnitt aus drei biologischen Replikaten mit Angabe der SD. Die Daten wurden mit 2-Wege-ANOVA, Sidaks Test (****p < 0,0001; IN- H3K4me3 ΔSMC5: ***p = 0,0009; IN- H3K4me3 ΔSLF2: ***p = 0,0007) analysiert.

Quelldaten

CEM-SS-Kontroll- und ΔSMC5-Zellen wurden mit gleichen Mengen an Vpr+- und Vpr-Versionen des IN-NL-GFPΔEnv-Indikatorvirus infiziert, wie durch ELISA gemessen, und die GFP-Expression wurde durch Durchflusszytometrie bei 3 dpi analysiert. (a) Fluoreszenzprofile aus einem repräsentativen Experiment. (b) Quantifizierung der Mittelwerte aus 3 unabhängigen biologischen Replikaten mit Angabe der SD.

Quelldaten

(a) WT- oder ΔSMC5-CEM-SS-Zellen wurden mit VSV-G-pseudotypisiertem IN + NL-GFPΔEnv in Gegenwart oder Abwesenheit von TAK-981 bei einer MOI von ~ 0,1 infiziert. Die Zellen wurden durch FACS bei 3 dpi sortiert und GFP-Zellen (rot markiert) für die in Abb. 4a dargestellten Experimente geerntet. (b) Der Gehalt an nicht integrierter HIV-1-2LTR-DNA wurde durch qPCR in mit WT HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellen quantifiziert, bis er bei 7 dpi auf den Hintergrundwert abfiel. Durchschnitt aus 3 biologischen Replikaten mit Angabe der SD. Die Daten wurden auf das Signal mit 2 dpi normalisiert, das auf 1,0 eingestellt war.

Quelldaten

WT- oder ΔSMC5-CEM-SS-Zellen wurden mit IN + NL-GFPΔEnv in Gegenwart und Abwesenheit des Integrase-Inhibitors Raltegravir infiziert. Diese Zellen wurden mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) infiziert, so dass die GFP+-Zellen sowohl im +ral als auch im -ral ungefähr identisch waren, wenn sie mit 5 dpi sortiert wurden, wie in Tafel A angegeben. Bei 2 dpi wurden die Zellen gewaschen, um Raltegravir zu entfernen und neu plattiert, um die Integration zu ermöglichen. GFP-Zellen wurden durch FACS bei 5 dpi isoliert und weitere 6 Tage (11 dpi) kultiviert, wo sie mit Verdünnungsmittel (DMSO), TAK-981, PMA oder TNF-α behandelt wurden. Die Zellen wurden dann mittels Durchflusszytometrie bei 12 dpi auf GFP-Expression analysiert. (a) Repräsentative GFP-Expressionsprofile aus einem einzelnen Experiment. (b) Zusammenstellung von 3 unabhängigen biologischen Replikaten mit Angabe der Mittelwerte und Angabe der SD. Datenanalyse mittels 2-Wege-ANOVA, Tukey-Test (****p < 0,0001).

Quelldaten

(a) In WT-HIV-1-infizierten primären CD4 + T-Zellen erreicht die nicht integrierte HIV-1-DNA ihren Höhepunkt bei 2 dpi und sinkt um 7 dpi auf Hintergrundwerte ab, gemessen durch qPCR-Analyse von zirkulärer viraler 2LTR-DNA. Diese Daten stellen den Durchschnitt von fünf biologischen Replikaten unter Verwendung von CD4 + T-Zellen dar, die von fünf verschiedenen Blutspendern erhalten wurden, wobei SD angegeben ist. Die Daten wurden auf das bei 2 dpi erkannte Signal normalisiert, das auf 1,0 eingestellt war. (b) Statistische Analyse der angegebenen GFP/mCherry-Subpopulationen in Zellen, die mit dem zweifarbigen HIV-1-Indikatorvirus infiziert und mit 150 nM TAK-981 bei 6 dpi im Vergleich zu Verdünnungsmittel (DMSO) bei 0 dpi behandelt wurden. Infizierte Zellen wurden bei 7 dpi geerntet und mittels FACS analysiert. Mit einem zweiseitigen Verhältnis-T-Test berechnete Statistiken.

Quelldaten

Lebende T-Zellen wurden basierend auf ihrer Größe und Granularität in einem Vorwärts-zu-Seite-Streudiagramm erfasst. Einzelne Zellen wurden in einem Diagramm der Vorwärtsstreuhöhe gegenüber der Vorwärtsstreufläche erfasst, um Dubletts zu entfernen. Die Tore für GFP+- und/oder GFP-Zellen werden anhand der nicht infizierten Kontrollen definiert und sind in den endgültigen Zahlen ersichtlich.

Ergänzende Angaben.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Unverarbeitete Western Blots.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Unverarbeitete Western Blots.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Irwan, ID, Bogerd, HP & Cullen, BR Epigenetische Stummschaltung durch den SMC5/6-Komplex vermittelt die HIV-1-Latenz. Nat Microbiol 7, 2101–2113 (2022). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01264-z

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Eingegangen: 23. Mai 2022

Angenommen: 10. Oktober 2022

Veröffentlicht: 14. November 2022

Ausgabedatum: Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-022-01264-z

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Nature Reviews Molekulare Zellbiologie (2023)