Die mechanische Stimulation steuert die Osteoklastenfunktion durch die Regulierung von Ca2+

Oct 27, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 407 (2023) Diesen Artikel zitieren

625 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Eine mechanische Kraftbelastung ist für die Aufrechterhaltung der Knochenhomöostase von wesentlicher Bedeutung, und eine Entlastung kann zu Knochenschwund führen. Osteoklasten sind die einzigen knochenresorbierenden Zellen und spielen eine entscheidende Rolle beim Knochenumbau. Die molekularen Mechanismen, die den durch mechanische Stimulation verursachten Veränderungen der Osteoklastenfunktion zugrunde liegen, müssen noch vollständig aufgeklärt werden. Unsere früheren Untersuchungen ergaben, dass der Ca2+-aktivierte Cl−-Kanal Anoctamin 1 (Ano1) ein wesentlicher Regulator für die Osteoklastenfunktion ist. Hier berichten wir, dass Ano1 Osteoklastenreaktionen auf mechanische Stimulation vermittelt. In vitro werden die Osteoklastenaktivitäten offensichtlich durch mechanischen Stress beeinflusst, der mit Veränderungen der Ano1-Spiegel, der intrazellulären Cl−-Konzentration und der Ca2+-Downstream-Signalisierung einhergeht. Ano1-Knockout- oder Calcium-Bindungsmutanten schwächen die Reaktion von Osteoklasten auf mechanische Stimulation ab. In vivo induzierte der Ano1-Knockout in Osteoklasten-Blunts durch die Belastung eine Hemmung der Osteoklasten und durch die Entladung den Knochenverlust. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ano1 eine wichtige Rolle bei durch mechanische Stimulation induzierten Veränderungen der Osteoklastenaktivität spielt.

Der Knochenumbau hängt in hohem Maße von mechanischer Stimulation ab, was durch eine erhöhte Knochenmasse bei Sportlern und einen dramatischen Knochenverlust unter Bedingungen langer Bettruhe1 oder Mikrogravitation während der Raumfahrt2 belegt wird. Mechanischer Stress erhöht die Knochenmasse vor allem durch die Erhöhung der Osteoblastenzahl, die Förderung ihrer Aktivität und die Hochregulierung ihrer Rekrutierung, wodurch die Knochenbildung stimuliert wird3,4. Umgekehrt reduziert das Fehlen mechanischer Stimulation die Knochenmasse, indem es die Knochenbildung hemmt5 und die Osteoklastogenese und die anschließende Knochenresorption6 fördert. Traditionell wurde angenommen, dass Osteoblasten und Osteozyten die Zellen sind, die für die Wahrnehmung mechanischer Reize verantwortlich sind, und ihre Rolle im Knochenstoffwechsel wurde ausführlich dokumentiert7,8. Dennoch wurde kaum über die Auswirkungen mechanischer Reize auf Osteoklasten berichtet, und der Mechanismus der Reaktion der Osteoklasten auf mechanischen Stress muss noch vollständig verstanden werden. Um die mechanischen Signale in der Klinik effektiv als nicht-medikamentöse Intervention bei Osteoporose zu nutzen, ist es wichtig, die Komponenten der mechanischen Herausforderung zu identifizieren, die für den Knochenumbau entscheidend sind.

Mechanische Reize stellen wichtige Umweltreize dar, die lebende Organismen wahrnehmen und bewältigen müssen5,9. Die Wahrnehmung mechanischer Kräfte ist in allen Bereichen des Lebens erhalten, wobei eine Vielzahl von Proteinen an der Wahrnehmung und Reaktion auf mechanische Kräfte beteiligt sind10,11,12. Unter ihnen werden mechanosensitive Ionenkanäle direkt durch mechanische Kräfte aktiviert, die auf die Zellen ausgeübt werden13,14. Zellen wandeln mechanische Reize über diese mechanosensitiven Ionenkanäle in elektrische oder chemische Signale um, die sich als Reaktion auf mechanische Reize öffnen und schließen15,16. Unser früherer Befund ergab, dass der mechanosensitive Piezo1-Kanal in Osteoblasten für die Knochenbildung erforderlich ist, da er als wichtiger Wandler der mechanosensitiven Funktion in Osteoblasten fungiert8. Die mechanosensitiven Ionenkanäle in Osteoklasten sind jedoch noch wenig untersucht.

Anoctamin-1 (ANO1), auch bekannt als TMEM16A, wurde als Calcium-aktivierter Chloridkanal identifiziert. ANO1 spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von Zellen, einschließlich der Kontrolle der Erregbarkeit glatter Muskelzellen17,18 und Neuronen19, der Flüssigkeitssekretion durch Epithelzellen20, der akuten Schmerzempfindung21, der olfaktorischen Transduktion22, der Proliferation, des Überlebens und der Migration von Krebszellen23,24. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass ANO1 ein wesentlicher Regulator der Osteoklastenfunktion ist und seine Kanalaktivität zu seiner Interaktion mit RANK beiträgt, was RANKL-induzierte Downstream-Signalwege fördert25.

Die Struktur der Kryo-EM von Ano1 zeigt, dass jede Untereinheit zehn Transmembransegmente (TM) umfasst, wobei TM3–8 einen ionenleitenden Pfad auskleidet. Bioinformatische Analysen, die auf Strategien zur Identifizierung entfernter phylogenetischer Beziehungen basieren, legen nahe, dass Ano1 evolutionär mit den mechanosensitiven Kanälen OSCA (Hyperosmolalitätsgesteuerter kalziumdurchlässiger Kanal) verwandt ist26. Angesichts der Merkmale der Kryo-EM-Karte und der strukturellen Ähnlichkeiten zwischen den mechanosensitiven OSCA-Kanälen und dem ANO1-Kanal schlagen wir außerdem vor, dass Proteine ​​der ANO-Familie dieselben mechanosensitiven Eigenschaften besitzen wie die mechanosensitiven OSCA-Ionenkanäle.

In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass mechanische Stimulation zu Veränderungen der Osteoklastenfunktion führt und Ano1 in diesem Prozess eine wesentliche Rolle spielt. Eine durch Flüssigkeitsscherstress (FSS) oder Hypergravitation (HG) induzierte mechanische Stimulation hemmte die Osteoklastenaktivität, was mit einem Rückgang der Ano1-Spiegel einherging. Umgekehrt führt die mechanische Entlastung unter simulierten Mikrogravitationsbedingungen (MG) zu einem Anstieg der Ano1-Spiegel und fördert anschließend die Osteoklastenaktivität. Ein ANO1-Mangel im Osteoklasten verringert seine Empfindlichkeit gegenüber mechanischer Stimulation. Mechanistisch gesehen wurde die Aktivität des ANO1-Kanals durch mechanische Signale verändert, was zu Veränderungen der intrazellulären Cl−-Konzentration und der kalziumvermittelten Signalwege führte. Ano1-Knockout in Osteoklasten hemmt die durch Entlastung induzierte Osteoklastenaktivierung erheblich und lindert den durch Entlastung verursachten Knochenverlust. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ano1 ein intrinsischer Faktor ist, der es Osteoklasten ermöglicht, auf mechanische Stimulation zu reagieren.

Um die Wirkung mechanischer Stimulation auf die Osteoklastenaktivität zu untersuchen, nutzten wir die folgenden drei mechanischen Kräfte: Flüssigkeitsscherspannung (FSS), Hypergravitation (HG) und simulierte Mikrogravitation (MG), um die Osteoklasten zu stimulieren. Eine Behandlung mit zwölf dyn/cm2 FSS und 4 g HG wurde verwendet, um die Auswirkung mechanischer Belastung zu untersuchen, und das simulierte Mikrogravitationssystem wurde verwendet, um die Auswirkung mechanischer Entlastung auf die Differenzierung und Aktivitäten von Osteoklasten zu untersuchen (ergänzende Abbildung 1a – c). Aus dem Knochenmark der Maus stammende Makrophagen (BMMs) wurden einen Tag lang nur mit M-CSF (10 ng/ml) und anschließend einen Tag lang mit M-CSF (30 ng/ml) und RANKL (50 ng/ml) kultiviert. 3 Tage und 5 Tage. Die Zellen wurden während des gesamten Prozesses mit FSS, HG und MG behandelt. Wir untersuchten die Expression der Markergene jedes Stadiums während der Osteoklastendifferenzierung27,28,29. Als die Zellen am ersten Tag mit FSS behandelt wurden, gab es keine Veränderung in der Expression der Integrin-Untereinheit Alpha X (Itgax) und Cd74, Markergenen des frühen Stadiums der Osteoklastendifferenzierung (ergänzende Abbildung 2a). Am dritten Tag wurde die Expression von Dendrozyten, die sieben Transmembranproteine ​​(Dcstamp) und ATPase H+ transportierende V0-Untereinheit d2 (Atp6v0d2), Markergene von Präosteoklasten, exprimierten, unterdrückt (ergänzende Abbildung 2b). Am Tag 5 war die Expression des Kernfaktors der aktivierten T-Zelle 1 (NFATc1), der sauren Phosphatase 5 (Acp5), des Cathepsin K (Ctsk) und des Matrixmetalloproteins 9 (Mmp9), Markergenen der Osteoklastenaktivität, signifikant verringert (ergänzende Abb . 2c). Der Proteinspiegel von NFATc1 war während der Osteoklastendifferenzierung erhöht und FSS hemmte den NFATc1-Proteinspiegel (Abb. 1a). Die Anzahl der TRAP+-Zellen war bei mit FSS behandelten Osteoklasten geringer als bei Kontrollosteoklasten (Abb. 1b). Ähnliche Ergebnisse wurden bei Osteoklasten nach der Behandlung mit HG beobachtet, die die Expression von Itgax und Cd74 nicht beeinflusste, die Expression von Dcstamp, Atp6v0d2, NFATc1, Acp5, Ctsk und Mmp9 herunterregulierte, den NFATc1-Proteinspiegel inhibierte und die Anzahl verringerte TRAP+-Zellen (Ergänzende Abb. 2d – f, Abb. 1c, d). Die Mikrogravitation verstärkte offensichtlich die Differenzierung und Aktivitäten von Osteoklasten, die Expression von Genen im frühen Stadium der Osteoklastendifferenzierung blieb unverändert (ergänzende Abbildung 2g), während die von Präosteoklasten- und Osteoklastengenen unter Behandlung mit MG signifikant höher war als die in Kontrollzellen ( Ergänzende Abbildung 2h, i). Der Proteingehalt von NFATc1 und die Anzahl der TRAP+-Zellen waren bei MG-behandelten Osteoklasten signifikant erhöht als bei Kontrollosteoklasten (Abb. 1e, f).

eine Western-Blot-Analyse des NFATc1-Proteinspiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter Behandlung mit flüssigem Scherstress (FSS) für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. b Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung während der Osteoklastendifferenzierung unter FSS-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage (links). Maßstabsbalken, 200 μm. Quantifizierung der Anzahl mehrkerniger Zellen pro cm2 (rechts). (n = 0–231, aus drei unabhängigen Experimenten). c Western-Blot-Analyse des NFATc1-Proteinspiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter Hypergravitationsbehandlung (HG) für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. d Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung während der Osteoklastendifferenzierung unter HG-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage (links). Maßstabsbalken, 200 μm. Quantifizierung der Anzahl mehrkerniger Zellen pro cm2 (rechts). (n = 0–291, aus drei unabhängigen Experimenten). e Western-Blot-Analyse des NFATc1-Proteinspiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter Mikrogravitationsbehandlung (MG) für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. f Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung während der Osteoklastendifferenzierung unter MG-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage (links). Maßstabsbalken, 200 μm. Quantifizierung der Anzahl mehrkerniger Zellen pro cm2 (rechts). (n = 0–377, aus drei unabhängigen Experimenten). g QRT-PCR-Analyse des Ano1-mRNA-Spiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter FSS-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. (n = 3 unabhängige Experimente). h Western-Blot-Analyse des Ano1-Proteinspiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter FSS-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. i QRT-PCR-Analyse des Ano1-mRNA-Spiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter HG-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. (n = 3 unabhängige Experimente). j Western-Blot-Analyse des Ano1-Proteinspiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter HG-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. k QRT-PCR-Analyse des Ano1-mRNA-Spiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter MG-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. (n = 3 unabhängige Experimente). l Western-Blot-Analyse des Ano1-Proteinspiegels während der Osteoklastendifferenzierung unter MG-Behandlung für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage. Bei allen Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Die statistische Analyse mit mehr als zwei Gruppen wurde mit einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Šídák-Post-hoc-Test durchgeführt, um Gruppenunterschiede zu bestimmen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass mechanische Kraft die Osteoklastenaktivität beeinflusst. Unsere vorherige Studie ergab, dass Ano1 eine wesentliche Rolle bei der Osteoklastenaktivität spielt. Die Merkmale der Kryo-EM-Karte von Ano1 und die strukturelle Ähnlichkeit von Ano1 mit mechanosensitivem OSCA veranlassten uns zu testen, ob Ano1 an der Reaktion der Osteoklasten auf mechanische Stimulation beteiligt war. Unter FSS- oder HG-Behandlung waren die Ano1-Spiegel in Osteoklasten signifikant verringert (Abb. 1g – j). Bei einer MG-Behandlung waren die Ano1-Spiegel bei Osteoklasten signifikant erhöht (Abb. 1k, l). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ano1 mit den durch mechanische Stimulation hervorgerufenen Veränderungen der Osteoklastenaktivitäten zusammenhängt.

Um festzustellen, ob Ano1 die hemmende Rolle der mechanischen Belastung bei Osteoklasten vermittelt, isolierten wir Osteoklasten aus osteoklastenspezifischen bedingten Ano1-Knockout-Mäusen (Ctsk-Cre; Ano1fl/fl). Die Ergebnisse zeigten, dass die Aktivitäten von Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten signifikant geringer waren als die von Ano1fl/fl-Osteoklasten (Abb. 2a–e). Wir haben die Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten 2 Tage lang 30 Minuten pro Tag FSS und 2 Tage lang HG ausgesetzt. Der Ano1-mRNA-Spiegel sank um 34,53 % und der Proteinspiegel von Ano1 sank um 47,8 % nach der FSS-Behandlung bei den Ano1fl/fl-Osteoklasten, es gab jedoch keine signifikanten Veränderungen bei den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten (Abb. 2a, b). ). Die FSS-Behandlung führte zu einer Reduzierung der Anzahl TRAP+-mehrkerniger Zellen um 40,7 % und zu einer signifikanten Verringerung der Expression von NFATc1, Acp5, Ctsk und Mmp9 in den Ano1fl/fl-Osteoklasten (Abb. 2c–e). Es ist bekannt, dass die konservierten Aminosäurereste E702 und E705 zwei Schlüsselstellen für die Ca2+-abhängige Kanalaktivierung sind, die für die Ano1-Aktivität wichtig sind. Um festzustellen, ob die Calciumbindungsstelle eine Schlüsselrolle bei der Ano1-vermittelten mechanischen Stimulation spielt, wurden Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten mit Vektor, Wildtyp-Ano1 (Ano1) oder mutiertem Ano1 (E702/E705Q) transfiziert und dann behandelt mit FSS. Wir fanden heraus, dass Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nicht auf FSS reagierten. Wildtyp-Ano1 kann die Reaktion von Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten auf FSS aufheben, nicht jedoch Ano1 mit Ca2+-Bindungsstellen-Mutanten (Abb. 2f). . In ähnlicher Weise führte die HG-Behandlung zu einer Verringerung sowohl der Ano1-mRNA- als auch der Proteinspiegel (Abb. 3a, b) und einer 22,5-prozentigen Verringerung der Osteoklastenzahl bei den Ano1fl/fl-Osteoklasten, jedoch nicht bei den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten ( Abb. 3c, d). Dementsprechend wurde die Expression von NFATc1, Acp5, Ctsk und Mmp9 auch in den Ano1fl/fl-Osteoklasten gehemmt, nicht jedoch in den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten (Abb. 3e). Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten reagierten ebenfalls nicht auf HG, Wildtyp-Ano1 kann die Reaktion von Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten auf HG aufheben, nicht jedoch Ano1 mit Ca2+-Bindungsstellen-Mutanten (Abb. 3f). Diese Daten legen nahe, dass die durch Ano1 vermittelte mechanische Belastung die Verringerung der Osteoklastenaktivität induzierte.

eine QRT-PCR-Analyse des Ano1-mRNA-Spiegels in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach Behandlung mit Ctrl oder FSS (12 dyn/cm2, 30 Min./Tag) für 2 Tage. (n = 3 unabhängige Experimente). b Western-Blot-Analyse des Ano1-Proteinspiegels in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach Behandlung mit Ctrl oder FSS (links). Die Quantifizierung des Ano1-Proteinspiegels in Osteoklasten (rechts). (n = 3 unabhängige Experimente). c Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach 2-tägiger Behandlung mit Ctrl oder FSS (12 dyn/cm2, 30 Min./Tag). Maßstabsbalken, 200 μm. d Quantifizierung der Anzahl mehrkerniger Zellen pro cm2. (n = 89–231, aus drei unabhängigen Experimenten). e QRT-PCR-Analyse der NFATc1-, Acp5-, Ctsk- und Mmp9-mRNA-Spiegel in den Osteoklasten Ano1fl/fl und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach 2-tägiger Behandlung mit Ctrl oder FSS. (n = 3 unabhängige Experimente). f QRT-PCR-Analyse der NFATc1-, Acp5-, Ctsk- und Mmp9-mRNA-Spiegel in Osteoklasten, die aus Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen isoliert wurden. Osteoklasten wurden mit NC, WT Ano1 oder mutiertem Ano1 (E702/705Q) transfiziert und 2 Tage lang mit oder ohne FSS behandelt. (n = 3 unabhängige Experimente). Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Die statistische Analyse mit mehr als zwei Gruppen wurde mit einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Šídák-Post-hoc-Test durchgeführt, um Gruppenunterschiede zu bestimmen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

eine QRT-PCR-Analyse des Ano1-mRNA-Spiegels in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach zweitägiger Behandlung mit Ctrl oder HG (4 g). (n = 3 unabhängige Experimente). b Western-Blot-Analyse des Ano1-Proteinspiegels in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach Behandlung mit Ctrl oder HG (links). Die Quantifizierung des Ano1-Proteinspiegels in Osteoklasten (rechts). (n = 3 unabhängige Experimente). c Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach zweitägiger Behandlung mit Ctrl oder HG (4 g). Maßstabsbalken, 200 μm. d Quantifizierung der Anzahl mehrkerniger Zellen pro cm2. (n = 109–312, aus drei unabhängigen Experimenten). e QRT-PCR-Analyse der NFATc1-, Acp5-, Ctsk- und Mmp9-mRNA-Spiegel in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach Behandlung mit Ctrl oder HG. (n = 3 unabhängige Experimente). f QRT-PCR-Analyse der NFATc1-, Acp5-, Ctsk- und Mmp9-mRNA-Spiegel in Osteoklasten, die aus Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen isoliert wurden. Osteoklasten wurden mit NC, WT Ano1 oder mutiertem Ano1 (E702/705Q) transfiziert und 2 Tage lang mit oder ohne HG behandelt. (n = 3 unabhängige Experimente). Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Die statistische Analyse mit mehr als zwei Gruppen wurde mit einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Šídák-Post-hoc-Test durchgeführt, um Gruppenunterschiede zu bestimmen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Um festzustellen, ob Ano1 in Osteoklasten an der Reaktion auf mechanische Belastung in vivo beteiligt ist, belasteten wir die linke Tibia von 16 Wochen alten weiblichen Ctsk-Cre; . Die TRAP-Färbung zeigte, dass eine mechanische Belastung über 2 Wochen Oc.S/BS und N.Oc/B.Pm der Tibia bei Ano1fl/fl-Mäusen reduzierte, nicht jedoch bei Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen (Ergänzende Abb. 3a, b). Die Expression von NFATc1, Acp5, Ctsk und Mmp9 war im Knochen von Ano1fl/fl-Mäusen, die mit mechanischer Belastung behandelt wurden, spezifisch verringert, nicht jedoch bei Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen (ergänzende Abbildungen 3c, d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ano1 in Osteoklasten eine wichtige Rolle bei der Reaktion des Knochens auf mechanische Belastung spielt.

Um festzustellen, ob Ano1 die Reaktion von Osteoklasten auf mechanische Entlastung vermittelte, wurden Osteoklasten von Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen einer Entlastungsbehandlung unterzogen. Nach zweitägiger Behandlung mit MG waren die mRNA- und Proteinspiegel von Ano1 bei den Ano1fl/fl-Osteoklasten signifikant um das 2,7-fache bzw. 2-fache erhöht, nicht jedoch bei den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten (Abb. 4a, B). Die MG-Behandlung führte zu einem zweifachen Anstieg der Anzahl mehrkerniger TRAP+-Zellen und erhöhte die Expression von Osteoklastenmarkergenen in den Ano1fl/fl-Osteoklasten signifikant, nicht jedoch in den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten (Abb. 4c–e). In ähnlicher Weise kann Wildtyp-Ano1 die Reaktion von Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten auf MG retten, nicht jedoch Ano1 mit Mutanten mit Ca2+-Bindungsstellen (Abb. 4f). Diese Daten legen nahe, dass Ano1-Knockout in Osteoklasten die durch mechanische Entladung verursachte mechanische Entladung verhindert Steigerung der Osteoklastenaktivität.

eine QRT-PCR-Analyse des Ano1-mRNA-Spiegels in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach zweitägiger Behandlung mit Ctrl oder MG. (n = 3 unabhängige Experimente). b Western-Blot-Analyse des Ano1-Proteinspiegels in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach 2-tägiger Behandlung mit Ctrl oder MG (links). Die Quantifizierung des Ano1-Proteinspiegels in Osteoklasten (rechts). (n = 3 unabhängige Experimente). c Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach zweitägiger Behandlung mit Ctrl oder MG. Maßstabsbalken, 200 μm. d Quantifizierung der Anzahl mehrkerniger Zellen pro cm2. (n = 130–453, aus sechs unabhängigen Experimenten). e QRT-PCR-Analyse der NFATc1-, Acp5-, Ctsk- und Mmp9-mRNA-Spiegel in Osteoklasten Ano1fl/fl und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach Behandlung mit Ctrl oder MG. (n = 3 unabhängige Experimente). f QRT-PCR-Analyse der NFATc1-, Acp5-, Ctsk- und Mmp9-mRNA-Spiegel in Osteoklasten, die aus Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen isoliert wurden. Osteoklasten wurden mit NC, WT Ano1 oder mutiertem Ano1 (E702/705Q) transfiziert und 2 Tage lang mit oder ohne MG behandelt. (n = 3 unabhängige Experimente). Bei allen Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Die statistische Analyse mit mehr als zwei Gruppen wurde mit einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Šídák-Post-hoc-Test durchgeführt, um Gruppenunterschiede zu bestimmen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Basierend auf den Eigenschaften von Ano1 als Chloridkanal untersuchen wir die Veränderungen des zytoplasmatischen Cl−-Spiegels in Osteoklasten als Reaktion auf mechanische Stimulation. Wir verwendeten einen Cl−-Sensor (die Fluoreszenzsonde, MQAE). Die Fluoreszenzintensität dieses Sensors steht im umgekehrten Verhältnis zur intrazellulären Cl−-Konzentration, und eine Abnahme der Fluoreszenzintensität korreliert mit einem Anstieg des zytoplasmatischen Cl−-Spiegels31. Interessanterweise wurde die Fluoreszenzintensität des Cl−-Sensors bei der FSS- und HG-Behandlung durch einen Anstieg der intrazellulären Cl−-Konzentration in den Ano1fl/fl-Osteoklasten signifikant um 46,5 % bzw. 42,4 % verringert, nicht jedoch in den Ctsk- Cre;Ano1fl/fl Osteoklasten (Abb. 5a, b). Bei der MG-Behandlung war jedoch die Fluoreszenzintensität des Cl−-Sensors erhöht, jedoch nicht bei den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten (Abb. 5c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mechanische Belastung die intrazellulären Cl−-Spiegel erhöhen und die Entlastung die intrazellulären Cl−-Spiegel im Osteoklasten senken könnte, was durch Ano1 vermittelt wurde.

Messung der intrazellulären Chloridkonzentration in Osteoklasten. Alle Zellen wurden mit 5 mM MQAE gefärbt. a Repräsentative Fluoreszenzbilder von Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach Behandlung mit Ctrl oder FSS (12 dyn/cm2, 30 Min./Tag) für 2 Tage (links). Maßstabsbalken, 100 μm. Die relative Fluoreszenzintensität von Osteoklasten (rechts). (n = 3 unabhängige Experimente). b Repräsentative Fluoreszenzbilder von Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach 2-tägiger Behandlung mit Ctrl oder HG (4 g) (links). Maßstabsbalken, 100 μm. Die relative Fluoreszenzintensität von Osteoklasten (rechts). (n = 3 unabhängige Experimente). c Repräsentative Fluoreszenzbilder von Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten nach 2-tägiger Behandlung mit Ctrl oder MG (links). Maßstabsbalken, 100 μm. Die relative Fluoreszenzintensität von Osteoklasten (rechts). (n = 3 unabhängige Experimente). Bei allen Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Die statistische Analyse mit mehr als zwei Gruppen wurde mit einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Šídák-Post-hoc-Test durchgeführt, um Gruppenunterschiede zu bestimmen. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Unsere vorherige Studie ergab, dass Ano1 für die RANKL-vermittelte CaMKIVCreb-Aktivierung während der Osteoklastogenese erforderlich ist. Um festzustellen, ob Ano1 die Osteoklastenreaktion auf mechanische Stimulation über den CaMKIV-Creb-Signalweg vermittelt, haben wir die Auswirkung mechanischer Belastung und Entladung auf die Phosphorylierung von CaMKIV und Creb getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Phosphorylierung von CaMKIV und Creb verringert war, was mit einer Herunterregulierung von NFATc1 in den Ano1fl/fl-Osteoklasten nach der Behandlung mit FSS oder HG einherging, es gab jedoch keine Veränderung bei den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten (Abb . 6a–h). Die Phosphorylierung von CaMKIV und Creb sowie die NFATc1-Proteinspiegel waren bei den Ano1fl/fl-Osteoklasten nach der Behandlung mit MG alle erhöht, es gab jedoch keine Veränderung bei den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten zwischen der Ctrl- und der MG-Gruppe (Abb. 6i– l). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CaMKIV-Creb-NFATc1-Signalübertragung an der durch Ano1 vermittelten mechanischen Stimulation der Osteoklastenaktivität beteiligt ist.

eine Western-Blot-Analyse der p-CaMKIV-, CaMKIV-, p-Creb-, Creb- und NFATc1-Proteinspiegel in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten mit Ctrl- oder FSS-Behandlung (12 dyn/cm2, 30 Min./Tag) für 2 Tage. b–d Die Quantifizierung der p-CaMKIV-, p-Creb- und NFATc1-Proteinspiegel in Osteoklasten. Der p-CaMKIV-Proteinspiegel wurde auf CaMKIV normalisiert, der p-Creb-Proteinspiegel wurde auf Creb normalisiert und der NFATc1-Proteinspiegel wurde auf Gapdh normalisiert. (n = 3 unabhängige Experimente). e Western-Blot-Analyse der p-CaMKIV-, CaMKIV-, p-Creb-, Creb- und NFATc1-Proteinspiegel in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten mit Ctrl- oder HG-Behandlung (4 g) für 2 Tage. f–h Die Quantifizierung der p-CaMKIV-, p-Creb- und NFATc1-Proteinspiegel in Osteoklasten. Der p-CaMKIV-Proteinspiegel wurde auf CaMKIV normalisiert, der p-Creb-Proteinspiegel wurde auf Creb normalisiert und der NFATc1-Proteinspiegel wurde auf Gapdh normalisiert. (n = 3 unabhängige Experimente). i Western-Blot-Analyse der p-CaMKIV-, CaMKIV-, p-Creb-, Creb- und NFATc1-Proteinspiegel in Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Osteoklasten mit Ctrl- oder MG-Behandlung für 2 Tage. j–l Die Quantifizierung der p-CaMKIV-, p-Creb- und NFATc1-Proteinspiegel in Osteoklasten. Der p-CaMKIV-Proteinspiegel wurde auf CaMKIV normalisiert, der p-Creb-Proteinspiegel wurde auf Creb normalisiert und der NFATc1-Proteinspiegel wurde auf Gapdh normalisiert. (n = 3 unabhängige Experimente). Bei allen Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung. Die statistische Analyse wurde mit einer Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Šídák-Post-hoc-Test durchgeführt, um Gruppenunterschiede zu bestimmen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Um festzustellen, ob Ano1 den durch mechanische Entlastung verursachten Knochenverlust vermittelt, verwendeten wir das Modell der Hinterbeinaufhängung (HS), um die Knochenveränderungen der Hinterbeine als Reaktion auf die Gewichtsentlastung zu untersuchen. Die drei Monate alten Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäuse wurden 28 Tage lang HS ausgesetzt. Die mRNA- und Proteinspiegel von Ano1 waren in Knochengeweben von Ano1fl/fl-Mäusen, die HS ausgesetzt waren, signifikant erhöht (Abb. 7a, b). Die Mikro-CT-Analyse zeigte, dass die trabekulären Knochenmasse- und -architekturbezogenen Parameter, einschließlich des Verhältnisses von Knochenvolumen zu Gewebevolumen (BV/TV), der Trabekelzahl (Tb.N) und der Trabekeldicke (Tb.Th), signifikant reduziert waren und der Trabekelabstand (Tb.Sp) war bei den Ano1fl/fl-Mäusen nach der Behandlung mit HS entsprechend erhöht (Abb. 7c, d). Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäuse, die HS ausgesetzt waren, zeigten eine viel höhere trabekuläre Knochenmasse, BV/TV, Tb.N und Tb.Th als Ano1fl/fl-Mäuse, die HS ausgesetzt waren. Dementsprechend war Tb.Sp bei Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen viel niedriger als bei den Kontrollmäusen (Abb. 7c, d). Als nächstes analysierten wir die entsprechenden Veränderungen der Osteoklastenfunktion nach der HS-Behandlung. Die TRAP-Färbung zeigte offensichtlich eine erhöhte Osteoklastenaktivität bei den Ano1fl/fl-Mäusen, die HS ausgesetzt waren. HS induzierte jedoch nur einen geringen Anstieg der TRAP-Aktivität bei Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen, der viel schwächer war als der bei Ano1fl/fl-Mäusen beobachtete (Abb. 7e). Die Osteoklastenoberfläche pro Knochenoberfläche (Oc.S/BS) und die Anzahl der Osteoklasten pro Knochenumfang (N.Oc/B.Pm) in der proximalen Tibia von Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen, die HS ausgesetzt waren, waren viel niedriger als in die Ano1fl/fl-Mäuse (Abb. 7f). Dementsprechend war der CTX-1-Spiegel im Serum der Ano1fl/fl-Mäuse signifikant erhöht, während er bei den Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen leicht anstieg (Abb. 7g). Die QRT-PCR-Analyse zeigte, dass die NFATc1-, Acp5-, Ctsk- und Mmp9-mRNA-Spiegel im Knochengewebe von Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen, die HS ausgesetzt waren, im Vergleich zu den Ano1fl/fl-Kontrollmäusen, die HS ausgesetzt waren, alle signifikant verringert waren (Abb. 7h). . Um die Veränderung der Knochenbildung bei Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen und Ano1fl/fl-Mäusen nach der HS-Behandlung zu überprüfen, injizierten wir Mäusen 10 Tage und 2 Tage vor der Euthanasie intraperitoneal Calcein, um die Bildung neuer Knochen zu markieren. Nach der Behandlung mit HS sanken die Mineralappositionsrate (MAR) und die Knochenbildungsrate pro Knochenoberfläche (BFR/BS) in den Tibias von Ano1fl/fl-Mäusen um 31 % bzw. 17 %. Ihre Werte in den Tibias von Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen sanken nach der HS-Behandlung im Vergleich zur Ctrl-Gruppe um 21 % bzw. 4 % (ergänzende Abbildung 4a, b).

a, b QRT-PCR-Analyse des Ano1-mRNA-Spiegels und Western-Blot-Analyse des Ano1-Proteinspiegels in Knochengeweben von Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen mit Ctrl- oder Hinterbeinsuspensionsbehandlung (HS). (n = 6 für jede Gruppe). c Repräsentative Bilder, die die dreidimensionale Trabekelarchitektur zeigen, ermittelt durch Mikro-CT-Rekonstruktion der distalen Femuren der angegebenen Mäusegruppen. Maßstabsbalken, 0,5 mm. d Mikro-CT-Messungen für Knochenvolumen pro Gewebevolumen (BV/TV), Trabekelzahl (Tb.N), Trabekeldicke (Tb.Th) und Trabekelabstand (Tb.Sp) in den distalen Femuren der angegebenen Mäusegruppen . (n = 6 für jede Gruppe). e Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung der proximalen Tibia der angegebenen Mäusegruppen. Maßstabsbalken, 50 μm. f Histomorphometrieanalyse der Bilder hinsichtlich der Anzahl der Osteoklasten pro Knochenumfang (N.Oc/B.Pm) und der Osteoklastenoberfläche pro Knochenoberfläche (Oc.S/BS). (n = 6 für jede Gruppe). g ELISA-Analyse des CTX-1-Proteinspiegels im Serum der angegebenen Mäusegruppen. (n = 6 für jede Gruppe). h QRT-PCR-Analyse der NFATc1-, Acp5-, Ctsk- und Mmp9-mRNA-Spiegel in Knochengewebe, das aus den angegebenen Mäusegruppen entnommen wurde. (n = 6 für jede Gruppe). Die statistische Analyse mit mehr als zwei Gruppen wurde mit der Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Šídák-Post-hoc-Test durchgeführt, um Gruppenunterschiede zu bestimmen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

In dieser Studie zeigen wir, dass Ano1 ein bisher nicht identifizierter mechanosensitiver Kanal in Osteoklasten ist. Wir fanden heraus, dass die Osteoklastenfunktion durch mechanische Behandlung reguliert wird, was mit Veränderungen der Ano1-Spiegel einhergeht. Unter Bedingungen einer Flüssigkeitsscherbeanspruchung von 12 dyn/cm2 oder einer Hypergravitation von 4 g wurde die Osteoklastenaktivität gehemmt und die Expression von Ano1 verringert. Umgekehrt fördert die simulierte Mikrogravitation die Osteoklastenaktivität und erhöht den Ano1-Spiegel. Hier identifizierten wir Ano1-Funktionen als wichtigen Regulator bei der Reaktion von Osteoklasten auf mechanischen Stress (Abb. 8). Darüber hinaus war unter mechanischer Belastung die intrazelluläre Chloridionenkonzentration erhöht und das Calciumsignal gehemmt. Die mechanische Entladung hingegen verringert die intrazelluläre Chloridionenkonzentration und fördert das Kalziumsignal. Für die Aufrechterhaltung der extrazellulären Ansäuerung sind intrazelluläre Cl−-Spiegel erforderlich. Ano1-Knockout- oder Ca2+-Bindungsstellen-Mutanten von Ano1 in Osteoklasten reagierten nicht auf mechanische Belastung oder Entlastung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ano1 durch seine kalziumregulierten Kanalaktivitäten als mechanischer Sensor in Osteoklasten fungiert.

Ano1 fungiert durch seine kalziumregulierten Kanalaktivitäten als mechanischer Sensor im Osteoklasten.

Im letzten Jahrzehnt war bekannt, dass Osteoblasten und Osteozyten am häufigsten auf mechanische Stimulation im Knochengewebe reagieren. Es wurde angenommen, dass die Veränderung der Osteoklastenfunktion unter verschiedenen mechanischen Reizen größtenteils Osteoblasten und Osteozyten zugeschrieben wird. Mechanische Belastung erhöht die Funktion von Osteoblasten und Osteozyten8,32,33. Osteoklastogenese und Osteoklastenfunktion werden durch die RANKL-Sekretion von Osteoblasten und Osteozyten reguliert34,35. Unter den Bedingungen der Mikrogravitation und der simulierten Mikrogravitation wird jedoch die Osteoblastenfunktion unterdrückt, die Knochenmasse und der Mineralstoffgehalt werden reduziert, die kortikalen und trabekulären Mikrostrukturen des Knochens werden beeinträchtigt32,36. Dennoch nimmt die Osteoklastenfunktion unter Bedingungen der Knochenentlastung immer noch zu, sowohl auf der Erde als auch im Weltraum. Dies wirft die Frage auf, welche intrinsischen Faktoren es Osteoklasten ermöglichen, unabhängig von Veränderungen in Osteoblasten oder Osteozyten empfindlich auf mechanische Reize zu reagieren. Ionenkanäle sind multimere porenbildende Proteine, die sich in der Plasmamembran befinden. Sie haben die Fähigkeit, sich als Reaktion auf verschiedene mechanische Signale zu öffnen und zu schließen37,38,39,40,41,42. Es gibt Hinweise darauf, dass die Differenzierung von Osteoklasten durch FSS durch morphologische Veränderungen und Veränderungen der Genexpression unterdrückt werden kann. Frühere In-vitro-Studien zeigten, dass es zwei Arten mechanischer Transduktionskanäle als Reaktion auf die FSS-Stimulation während der Osteoklastendifferenzierung gibt. Insbesondere vermittelt das Typ-1A-Transmembranprotein Stroma Interacting Molecule 1 (STIM1) die FSS-induzierte [Ca2+]i-Oszillation im frühen Stadium der Osteoklastendifferenzierung, während TRPV4, Mitglied der Transient-Rezeptor-Potential-Familie (TRP), eine wichtige Rolle bei FSS-induziertem Ca2+ spielt Fluss und [Ca2+]i-Oszillation im späten Stadium der Osteoklastendifferenzierung43. In unserer Studie haben wir herausgefunden, dass FSS- und HG-Stimulation die Ano1-Expression und Kanalaktivität hemmen, indem sie das intrazelluläre [Cl−]i erhöhen und den Ca2+-aktivierenden Downstream-Signalweg in Osteoklasten hemmen. Im Gegensatz dazu fördert die MG-Stimulation die Ano1-Expression und Kanalaktivität, indem sie intrazelluläres [Cl−]i reduziert und den Ca2+-aktivierenden Downstream-Signalweg aktiviert.

Kürzlich wurde die Kryo-EM-Struktur von Ano1 aufgeklärt, was seine strukturelle Homologie zu mechanosensitiven Kanälen wie OSCA1.2 und anderen Mitgliedern der OSCA-Familie offenbarte. Sie haben ähnliche dimere Architekturen, Transmembrandomänenstrukturen und Porenpositionen26. Diese Ergebnisse legen eine mögliche Rolle von Ano1 bei der Mechanosensation nahe. Hier fanden wir heraus, dass die Reaktion von Osteoklasten auf mechanische Stimulation Ano1-abhängig ist. Ano1-Spiegel und -Aktivität unterstreichen die Wirkung mechanischer Stimulation auf Osteoklasten. Darüber hinaus wird die Expression von Ano1 durch unterschiedliche mechanische Stimulation moduliert. Mechanische Belastung verringert die Ano1-Werte, während mechanisches Entladen die Ano1-Werte erhöht. Ano1-Knockout in Osteoklasten schwächt deren Empfindlichkeit gegenüber mechanischer Stimulation erheblich ab. Um Ano1 jedoch als Mechanosensor zu bestimmen, müssen die Veränderungen der Architektur von Ano1-Kanälen unter mechanischer Stimulation weiter aufgeklärt werden.

Zusammenfassend belegen unsere Ergebnisse, dass die Aktivitäten von Osteoklasten offensichtlich durch mechanischen Stress beeinflusst werden, der mit veränderten Ano1-Spiegeln, der intrazellulären Cl−-Konzentration und der Ca2+-Signalisierung einhergeht. Osteoklastenspezifische Ano1-Knockout-Mäuse sind resistent gegen entlastungsbedingten Knochenverlust, indem sie die Osteoklastenreaktion abschwächen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ano1 ein intrinsischer Faktor ist, der Osteoklasten die Fähigkeit verleiht, auf mechanische Stimulation zu reagieren. Ano1-spezifische Inhibitoren sind ein vielversprechender Ansatz, um dem Knochenschwund entgegenzuwirken.

Die mit Ano1 gefloxten Mäuse (Ano1fl/fl, ein großzügiges Geschenk von Dr. Min-Sheng Zhu)44 wurden mit dem Ctsk-Cre-Stamm (ein großzügiges Geschenk von Dr. Weiguo Zou)45 gekreuzt, um Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäuse zu erzeugen . Alle analysierten Mäuse wurden auf dem C57BL/6-Hintergrund gehalten. Die Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen im Animal Research Building des China Astronaut Research and Training Center gezüchtet und gehalten (12-Stunden-Licht-, 12-Stunden-Dunkel-Zyklen, Temperaturkontrolle bei 21 ± 2 °C mit freiem Zugang zu Futter und Wasser). Alle experimentellen Verfahren wurden von den Ausschüssen für Tierethik und experimentelle Sicherheit des China Astronaut Research and Training Center genehmigt (Referenznummer: ACC-IACUC-2022-002).

Aus dem Knochenmark der Maus stammende Makrophagen (BMMs) wurden aus Schienbeinen und Oberschenkelknochen von 6 bis 8 Wochen alten männlichen Mäusen gewonnen. Knochenmarkszellen wurden mit vollständigem α-Minimal-Essentialmedium (α-MEM, 10 % fötales Rinderserum [FBS] und Penicillin/Streptomycin) gespült und gesammelt. Die Zellen wurden mit vollständigem α-MEM-Medium in Gegenwart von Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF; 10 ng/ml, R&D Systems) einen Tag lang kultiviert. Suspensionszellen wurden gesammelt und auf einen Glasobjektträger oder eine Flash-Kultur geimpft. Die Zellen wurden in induziertem Medium-Komplettmedium mit 30 ng/ml M-CSF und 50 ng/ml Rezeptoraktivator des Kernfaktor-kB-Liganden (RANKL; R&D Systems) kultiviert. Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage ausgetauscht.

Die TRAP-Färbung wurde unter Verwendung eines sauren Phosphatase-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. 387) durchgeführt. Die über einen bestimmten Zeitraum kultivierten Zellen wurden mit Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen und mit 4 % Formaldehyd 5 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert und gründlich in PBS gespült. Die Zellen wurden in TRAP-Färbelösung bei 37 °C für 0,5–1 Stunde unter Lichtschutz inkubiert. Nach dem Entfernen der TRAP-Lösung wurden die Platten dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. TRAP-positive mehrkernige Zellen mit drei oder mehr Kernen wurden unter einem Umkehrmikroskop (Nikon) gezählt.

Die Schienbeine der Maus wurden gehäutet und 48 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Tibia wurden 10–15 Tage lang mit 10 % EDTA entkalkt, dann dehydriert und in Paraffin eingebettet. 5–7 μm große Schnitte wurden auf einem Rotationsmikrotom angefertigt. Die Schnitte wurden entwachst und mit TRAP-Färbelösung 1 Stunde lang bei 37 °C unter Lichtschutz inkubiert. Zur Gegenfärbung wurde Methylgrün verwendet. Die Bilder wurden mit einem Mikroskop aufgenommen und statistische Analysen wurden mit dem BioquantOsteo Analysis System durchgeführt.

Die Gesamt-RNA wurde aus Zellen oder Geweben mit TRIzol-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die reverse Transkription wurde mit 0,5 µg Gesamt-RNA in einem Gesamtvolumen von 10 µl pro Reaktion durchgeführt. RNA wurde mit dem PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, RR037A) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers in cDNA transkribiert. Quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR) mit einem TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Takara, RR820A). Gapdh wurde als Normalisierungskontrolle für mRNA verwendet. Alle Primer wurden von BGI (Peking, China) hergestellt. Die folgenden Primer wurden verwendet: Gapdh F: ACATCATCCCTGCATCCACTG, R: TCATTGAGAGCA ATGCCAGC; NFATc1 F: ACGCTACAGCTGTTCATTGG, R: CTTTGGTGTTGGACAGGATG; Acp5 F: GCGACCATTGTTAGCCACATACG, R: CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT; Mmp9 F: GCTGACTACGATAAGGACGGCA, R: GCGGCCCTCAAAGATGAACGG; Ctsk F: GCGTTGTTCTTATTCCGAGC, R: CAGCAGAGGTGTGTACTATG; Ano1 F: CCCGTGCCAGTCACCTTTTT, R: TCATCTGCTTTCCGTTTCCAGT.

Die Zellen wurden in Lysepuffer (RIPA-Puffer, 1 mM PMSF, Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und Protease-Inhibitor-Cocktail) auf Eis 15 Minuten lang lysiert. Knochengewebe wurde mit einem Mörser in flüssigem Stickstoff zermahlen und 30 Minuten lang in Lysepuffer bei 4 °C lysiert. Proteinfraktionen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g und 4 °C gesammelt und anschließend wurden 10 mg Lysate einer SDS-PAGE unterzogen und auf Nitrozellulose-Filtermembranmembranen (NC) übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch blockiert und über Nacht mit spezifischen Antikörpern inkubiert. Die verwendeten Antikörper wurden aufgelistet: Kaninchen-Anti-NFATc1 (1:1000, abklonal, A1539), Kaninchen-Anti-Ano1 (1:1000, abklonal, A10498), Kaninchen-Anti-p-CaMKIV-Antikörper (1:1000, ImmunoWay, YP0043). ), Kaninchen-Anti-CaMKIV-Antikörper (1:1000, Cell Signaling Technology, 4032), Kaninchen-Anti-Creb-Antikörper (1:1000, Cell Signaling Technology, 9197), Kaninchen-Anti-p-Creb-Antikörper (1:1000, Cell Signaling Technology, 9198), Kaninchen-Anti-Gapdh-Antikörper (1:5000, Abways, AB0036).

Der Flüssigkeitsfluss wurde auf Zellen in einer parallelen Plattenströmungskammer unter Verwendung eines geschlossenen Strömungskreislaufs ausgeübt. Osteoklasten wurden in einer Dichte von 4 × 106 Zellen auf 22 × 26 mm große Glasdeckgläser ausgesät und 3 Tage lang in α-MEM-Medium mit RANKL und M-CSF kultiviert. Deckgläschen wurden in die Parallelplatten-Durchflusskammer gegeben und 30 Minuten/Tag mit 12 dyn/cm2 FSS behandelt. Das Gerät wurde während der gesamten Dauer des Experiments auf 37 °C gehalten. Die Korrelation zwischen FSS und Durchflussrate wurde mithilfe der Gleichung berechnet: τ = 6μQ/bh2, wobei Q die Durchflussrate (cm3/s), μ die Viskosität des Durchflussmediums (0,01 dyn/cm2) und h die Höhe ist des Kanals (0,05 cm), b ist die Schlitzbreite (2,5 cm) und τ ist die Wandschubspannung (Dyne/cm2). Die Parallelplatten-Strömungskammer wurde bereits beschrieben8,46.

Eine Hypergravitationszentrifuge wurde verwendet, um die Auswirkungen der Hypergravitation auf Osteoklasten festzustellen. In dieser Studie wurden Osteoklasten mit einer Dichte von 107 Zellen auf 12,5-cm2-Zellkulturflaschen ausgesät und 3 Tage lang in α-MEM-Medium mit RANKL (50 ng/ml) und M-CSF (30 ng/ml) kultiviert. Um das Vorhandensein von Luftblasen zu verhindern, wurden die Kolben mit Kulturmedium aufgefüllt. Die Kolben wurden sorgfältig an der rotierenden Platte der Hypergravitationszentrifuge befestigt und mit einer konstanten Geschwindigkeit von 4 g unter Hypergravitationsbedingungen bei 37 °C gedreht. Zur Kontrolle wurden Zellen auf die gleiche Weise, jedoch ohne Klinorotation (1 g), kultiviert. Die Hypergravitationszentrifuge wurde bereits beschrieben32.

Wir haben einen 2D-Klinostaten verwendet, um die Schwerelosigkeit zu simulieren. Der 2D-Klinostat wurde vom China Astronaut Research and Training Center (Peking, China) entwickelt und bereitgestellt. Durch die Rotation entsteht ein Schwerkraftvektor, der für Zellen nicht erkennbar ist. Daher verhindert das Gerät, dass die Zellen die Schwerkraft spüren. Die Verarbeitungsmethoden der Osteoklasten folgten der Beschreibung der rotationssimulierten Mikrogravitation. Die Kolben wurden sorgfältig an der rotierenden Platte des Clinostat-Systems befestigt und mit einer konstanten Geschwindigkeit von 30 U/min/min gedreht, um die Mikrogravitation (0,01 g) zu simulieren. Zur Kontrolle wurden Zellen auf die gleiche Weise kultiviert, jedoch ohne Klinorotation (1 g). Der 2D-Klinostat wurde bereits beschrieben8,32.

Osteoklasten wurden 30 Minuten lang mit 5 mM MQAE (Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., China) inkubiert und dann fünfmal mit PBS gespült. Zellfluoreszenzbilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM, Leica SP5, Deutschland) mit Anregungslicht 350 nm und Emissionslicht 460 nm durchgeführt. Änderungen in [Cl−]i wurden durch die Änderungen in der Fluoreszenzintensität dargestellt. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität jeder Zelle wurde mit der Image J-Software analysiert.

Das Entladen der Hinterbeine wurde durch eine Schwanzaufhängung erreicht. Alle männlichen Mäuse wurden unter Standard-Tierhaltungsbedingungen gehalten. Die 3 Monate alten männlichen Ano1fl/fl- und Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäuse wurden einzeln in Käfigen gehalten und am Schwanz mit einem Streifen chirurgischen Klebebands aufgehängt, der an einer Kette befestigt war, die an einer Rolle hing. Die Mäuse wurden in einem Winkel von 30° zum Boden aufgehängt, wobei nur die Vorderbeine den Boden berührten. Dadurch konnten sich die Mäuse bewegen und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Mäuse wurden 28 Tage lang einer Entlastung der Hinterbeine durch die Schwanzaufhängung unterzogen. Wir injizierten Mäusen 10 Tage und 2 Tage vor der Euthanasie intraperitoneal Calcein (30 mg/kg, Sigma), um die Bildung neuer Knochen zu markieren. Nach der Euthanasie wurden das Serum und das gesamte Knochengewebe gesammelt. Alle experimentellen Verfahren wurden von den Ausschüssen für Tierethik und experimentelle Sicherheit des China Astronaut Research and Training Center genehmigt.

Gemäß einem Protokoll30 haben wir die linke Tibia von 16 Wochen alten weiblichen Ctsk-Cre;Ano1fl/fl-Mäusen und Ano1fl/fl-Mäusen mit einer Spitzenbelastung von +1200 με am Mittelschaft belastet, wobei wir ein Electroforce BOSE 5100 verwendet haben. Die linke Tibia von jedem Die Maus wurde zwei Wochen lang an fünf aufeinanderfolgenden Tagen pro Woche belastet (Tag 1–5 und Tag 8–12), und die Belastung wurde in 1200 Zyklen mit einer 4-Hz-Dreieckswellenform und einer Ruhezeit von 0,1 s zwischen jedem Zyklus ausgeübt. Nach der Euthanasie wurde am 15. Tag Knochengewebe entnommen.

Die Oberschenkelknochen der Mäuse wurden gehäutet und in 75 %igem Ethanol fixiert. Für den distalen Femur und die proximale Tibia wurde die gesamte sekundäre Spongiosa des distalen Femurs und der proximalen Tibia jeder Maus ex vivo mit einem Mikro-CT-System (mCT40, SCANCO MEDICAL, Schweiz) gescannt. Kurz gesagt, 80 Scheiben trabekulärer Knochen proximal zur distalen Wachstumsfuge wurden zur Analyse des Knochenvolumens pro Gewebevolumen (BV/TV), der Trabekelzahl (Tb.N), der Trabekeldicke (Tb.Th) und des Trabekelabstands (Tb.) ausgewählt. Sp).

Die Analysen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers für Serumkonzentrationen von CTX-1 mit dem Maus-CTX1-ELISA-Kit (Sangon Biotech, D721204) durchgeführt. Dieser Assay verwendet die Sandwich-Enzym-Immunoassay-Technik. Fügen Sie Standard und Probe zu der Mikrotiterplatte hinzu, die mit Anti-Maus-CTX1-Antikörper vorbeschichtet wurde. Nach der Inkubation Biotin-konjugierten Anti-Maus-CTX1-Antikörper hinzufügen. Anschließend wird es mit HRP-konjugiertem Streptavidin kombiniert, um einen Immunkomplex zu bilden, dann inkubiert und gewaschen, um ungebundenes Enzym zu entfernen, und dann zum chromogenen Substrat TMB zugegeben, um eine blaue Farbe zu erzeugen, und unter Einwirkung von Säure in das endgültige Gelb umgewandelt. Schließlich wurde der Absorptionswert (OD) bei 450 nm gemessen. Die Konzentration von Maus-CTX1 in der Probe war proportional zum OD-Wert. Die Konzentration von Maus-CTX1 in der Probe kann durch Zeichnen einer Standardkurve berechnet werden.

Zellbasierte Experimente wurden in mindestens drei unabhängigen Wiederholungen durchgeführt. Die Tiere wurden randomisiert in verschiedene Gruppen eingeteilt und für jede Gruppe wurden mindestens 5 Mäuse verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Der Student-t-Test wurde für statistische Auswertungen von zwei Gruppenvergleichen verwendet. Die statistische Analyse mit mehr als zwei Gruppen wurde mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Alle statistischen Analysen wurden mit der Prism-Software (Graphpad Prism für Windows, Version 8.0) durchgeführt. Unterschiede wurden bei *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 als signifikant angesehen.

Die im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten werden im Hauptpapier (Abb. 1–8) und in ergänzenden Abbildungen (Ergänzende Abb. 1–4) bereitgestellt. Die Original-Gel- und Blot-Bilder sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 5–8. Die Quelldaten für die Grafiken und Bilder finden Sie in den ergänzenden Excel-Dateien (Ergänzungsdaten). Alle Ressourcen sind auf begründete Anfrage auch bei den Autoren erhältlich.

Robling, A., Castillo, A. & Turner, C. Biomechanische und molekulare Regulierung des Knochenumbaus. Annu. Rev. Biomed. Ing. 8, 455–498 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vico, L. & Hargens, A. Skelettveränderungen während und nach dem Raumflug. Nat. Rev. Rheumatol. 14, 229–245 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Xie, Z. et al. Mechanische Kraft fördert die durch Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase 1 vermittelte Hydrolyse des asymmetrischen Metaboliten Dimethylarginin, um die Knochenbildung zu fördern. Nat. Komm. 13, 50 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Deng, R. et al. Periostale CD68(+) F4/80(+)-Makrophagen sind mechanosensitiv für die kortikale Knochenbildung durch Sekretion und Aktivierung von TGF-β1. Adv. Wissenschaft. 9, e2103343 (2022).

Artikel Google Scholar

Zhou, T. et al. Piezo1/2 vermitteln die für die Knochenbildung essentielle Mechanotransduktion durch konzertierte Aktivierung von NFAT-YAP1-ß-Catenin. Elife 9, e52779 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miyazaki, T. et al. Mechanische Regulierung der Knochenhomöostase durch p130Cas-vermittelte Linderung der NF-κB-Aktivität. Wissenschaft. Adv. 5, eaau7802 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yavropoulou, MP & Yovos, JG Die molekulare Basis der Knochenmechanotransduktion. J. Bewegungsapparat. Neuronal. Interagieren. 16, 221–236 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, W., et al. Für den Knochenaufbau ist der mechanosensitive Piezo1-Kanal erforderlich. Elife 8, e47454 (2019).

Ingber, DE & Di Carlo, D. Interdisziplinarität und Mechanobiologie. iScience 25, 104187 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kefauver, JM, Ward, AB & Patapoutian, A. Entdeckungen in Struktur und Physiologie mechanisch aktivierter Ionenkanäle. Natur 587, 567–576 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Razzell, W., Bustillo, ME & Zallen, JA Das kraftempfindliche Protein Ajuba reguliert die Zelladhäsion während der Epithelmorphogenese. J. Cell Biol. 217, 3715–3730 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mishra, R. et al. Proteinkinase C und Calcineurin vermitteln gemeinsam das Überleben der Zellen unter mechanischer Druckbelastung. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 114, 13471–13476 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Douguet, D. & Honore, E. Mechanoelektrische Transduktion bei Säugetieren: Struktur und Funktion von kraftgesteuerten Ionenkanälen. Zelle 179, 340–354 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lewis, AH & Grandl, J. Stretch- und Poke-Stimulation zur Charakterisierung mechanisch aktivierter Ionenkanäle. Methoden Enzymol. 654, 225–253 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jin, P., Jan, LY & Jan, YN Mechanosensitive Ionenkanäle: Strukturmerkmale, die für Mechanotransduktionsmechanismen relevant sind. Annu. Rev. Neurosci. 43, 207–229 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Martinac, B. et al. Zellmembranmechanik und mechanosensorische Transduktion. Curr. Spitze. Membranen 86, 83–141 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Thomas-Gatewood, C. et al. TMEM16A-Kanäle erzeugen Ca(2)(+)-aktivierte Cl(-)-Ströme in glatten Muskelzellen der Hirnarterie. Bin. J. Physiol. Herzkreislauf. Physiol. 301, H1819–H1827 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hwang, SJ et al. Die Expression von Anoctamin 1/TMEM16A durch interstitielle Zellen von Cajal ist für die langsame Wellenaktivität in den Magen-Darm-Muskeln von grundlegender Bedeutung. J. Physiol. 587, 4887–4904 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, WC et al. Calciumaktivierte Chloridkanäle (CaCCs) regulieren das Aktionspotential und die synaptische Reaktion in Neuronen des Hippocampus. Neuron 74, 179–192 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jang, Y. & Oh, U. Anoctamin 1 in sekretorischen Epithelien. Cell Calcium 55, 355–361 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Takayama, Y., Derouiche, S., Maruyama, K. & Tominaga, M. Neue Perspektiven zur Schmerzbehandlung durch Modulation von TRP-Kanälen und ANO1. Int. J. Mol. Wissenschaft. 20, 3411 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Billig, GM, Pal, B., Fidzinski, P. & Jentsch, TJ Ca2+-aktivierte Cl--Ströme sind für den Geruchssinn entbehrlich. Nat. Neurosci. 14, 763–769 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bill, A. & Alex Gaither, L. Die mechanistische Rolle des kalziumaktivierten Chloridkanals ANO1 beim Tumorwachstum und der Signalübertragung. Adv. Exp. Med. Biol. 966, 1–14 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Crottes, D. & Jan, LY Die vielfältige Rolle von TMEM16A bei Krebs. Zellkalzium 82, 102050 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, W. et al. Anoctamin 1 steuert die Knochenresorption, indem es die Aktivierung des Cl(-)-Kanals mit der RANKL-RANK-Signalübertragung koppelt. Nat. Komm. 13, 2899 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, M. et al. Struktur der mechanosensitiven OSCA-Kanäle. Nat. Struktur. Mol. Biol. 25, 850–858 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Negishi-Koga, T. & Takayanagi, H. Die Ca2+-NFATc1-Signalübertragung ist eine wesentliche Achse der Osteoklastendifferenzierung. Immunol. Rev. 231, 241–256 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tsukasaki, M. et al. Schrittweise Entscheidungswege über das Zellschicksal während der Osteoklastogenese bei Einzelzellauflösung. Nat. Metab. 2, 1382–1390 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, Q. et al. Unterdrückung der Osteoklasten-Multinukleation durch ein auf posttranskriptioneller Regulierung basierendes räumlich-zeitlich selektives Abgabesystem. Wissenschaft. Adv. 8, eabn3333 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, X. et al. Die Stimulation von Piezo1 durch mechanische Signale fördert den Knochenanabolismus. Elife 8, e49631 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanoni, S. et al. Identifizierung von Anoctamin 1 (ANO1) als Schlüsselfaktor für die Proliferation des Ösophagusepithels bei eosinophiler Ösophagitis. J. Allergieklinik. Immunol. 145, 239–254.e232 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, C. et al. Die mechanosensitive lncRNA Neat1 fördert die Osteoblastenfunktion durch Paraspeckle-abhängige Smurf1-mRNA-Retention. Knochenres. 10, 18 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sato, T. et al. Eine FAK/HDAC5-Signalachse steuert die Mechanotransduktion der Osteozyten. Nat. Komm. 11, 3282 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, L. et al. Die gezielte Deletion von Ptpn11 bei Mäusen zeigt die wesentliche Rolle von SHP2 bei der Differenzierung von Osteoblasten und der Skeletthomöostase. Knochenres. 9, 6 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakashima, T. et al. Hinweise auf die Regulierung der Knochenhomöostase durch Osteozyten durch RANKL-Expression. Nat. Med. 17, 1231–1234 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Man, J., Graham, T., Squires-Donelly, G. & Laslett, AL Die Auswirkungen der Mikrogravitation auf Knochenstruktur und -funktion. NPJ Microgravity 8, 9 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Beaulieu-Laroche, L. et al. TACAN ist ein Ionenkanal, der an der Wahrnehmung mechanischer Schmerzen beteiligt ist. Zelle 180, 956–967.e917 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ranade, SS, Syeda, R. & Patapoutian, A. Mechanisch aktivierte Ionenkanäle. Neuron 87, 1162–1179 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J., Lewis, AH & Grandl, J. Berührung, Spannung und Transduktion – die Funktion und Regulierung von Piezo-Ionenkanälen. Trends Biochem. Wissenschaft. 42, 57–71 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Du, G. et al. Rollen von TRPV4 und Piezokanälen bei der durch Dehnung hervorgerufenen Ca(2+)-Reaktion in Chondrozyten. Exp. Biol. Med. 245, 180–189 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Murthy, SE et al. OSCA/TMEM63 sind eine evolutionär konservierte Familie mechanisch aktivierter Ionenkanäle. Elife 7, e41844 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Takahashi, K. & Naruse, K. Dehnungsaktivierter BK-Kanal und Herzfunktion. Prog. Biophys. Mol. Biol. 110, 239–244 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, P. et al. STIM1 und TRPV4 regulieren die durch den Flüssigkeitsfluss induzierte Kalziumoszillation in frühen und späten Stadien der Osteoklastendifferenzierung. Zellkalzium 71, 45–52 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Danielsson, J. et al. Antagonisten des kalziumaktivierten Chloridkanals TMEM16A modulieren den Tonus der glatten Atemwegsmuskulatur und das intrazelluläre Kalzium. Anaesthesiology 123, 569–581 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, L. et al. Das mechanische Sensorprotein PIEZO1 reguliert die Knochenhomöostase über Osteoblasten-Osteoklasten-Überlagerung. Nat. Komm. 11, 282 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, C. et al. Flüssigkeitsscherstress unterdrückt die Osteoklastendifferenzierung in RAW264.7-Zellen über den Signalweg der extrazellulären signalregulierten Kinase 5 (ERK5). Med. Wissenschaft. Überwachen. 26, e918370 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken Min-Sheng Zhu (Universität Nanjing, Nanjing, China) für die Bereitstellung der ANO1-Flox-Mäuse und Weiguo Zou (Shanghai-Institut für Biochemie und Zellbiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China) für die Bereitstellung der Ctsk-Cre-Mäuse. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81830061, 82192882 an Yingxian L., 82072108 an Yuheng L. und 32000879 an JL), dem Space Medical Experiment Project des China Manned Space Program (HYZHXM01006) an YingxianL, unterstützt.

Beijing Key Laboratory for Separation and Analysis in Biomedicine and Pharmaceuticals, Beijing Institute of Technology, Peking, China

Weijia Sun & Rongji Dai

Staatliches Schlüssellabor für Grundlagen und Anwendung der Weltraummedizin, China Astronaut Research and Training Center, Peking, China

Weijia Sun, Yuheng Li, Jianwei Li, Yingjun Tan, Xinxin Yuan, Guohui Zhong, XiaoYan Jin, Zizhong Liu, Ruikai Du, Wenjuan

Institut für Orthopädie, Chinesisches PLA-Allgemeinkrankenhaus, Peking, China

Haoye Meng, Jianting Ye und Aiyuan Wang

Oujiang Laboratory (Zhejiang Lab for Regenerative Medicine, Vision and Brain Health), Wenzhou, Zhejiang, China

Shukuan Ling

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

WS entwarf und führte die meisten Experimente durch, analysierte Daten und erstellte das Manuskript; Yuheng L. trug zur μCT-Analyse bei; JL hat die Tierversuche entworfen; YT steuerte Klinostat-, Hypergravitationszentrifugen- und Flüssigkeitsscherspannungsanlagen bei. HM, JY und AW stellten mechanische Belastungsgeräte und Analysesysteme zur Verfügung, GZ, XY und XJ halfen bei der In-vivo-Behandlung; DZ, ZL, RDWX und JS lieferten Vorschläge für die Manuskriptvorbereitung. Youyou L., JP, YZ und QL lieferten experimentelle Materialunterstützung; SL, RD und Yingxian L. leiteten die Studie und überarbeiteten das Papier.

Korrespondenz mit Shukuan Ling, Rongji Dai oder Yingxian Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Zhousheng Xiao und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Martina Rauner und Christina Karlsson Rosenthal.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Sun, W., Li, Y., Li, J. et al. Die mechanische Stimulation steuert die Osteoklastenfunktion durch die Regulierung des Ca2+-aktivierten Cl−-Kanals Anoctamin 1. Commun Biol 6, 407 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04806-1

Zitat herunterladen

Eingegangen: 24. August 2022

Angenommen: 04. April 2023

Veröffentlicht: 13. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04806-1

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.